C9orf72六核苷酸重复扩增损害ALS患者小胶质细胞应答——《nature neuroscience》2025年11月刊报道详解

一、学术背景与研究动机

肌萎缩侧索硬化症（ALS, Amyotrophic Lateral Sclerosis）是一种以运动神经元进行性丧失为特征的致残性神经退行性疾病，患者常在发病3年内死亡。除运动症状外，部分患者还表现为认知和行为障碍。遗传学证据显示，ALS具有强烈的遗传易感性，其中以C9orf72（chromosome 9 open reading frame 72）基因上的GGGGCC六核苷酸重复扩增（hexanucleotide repeat expansions, HRE）最为常见。这种扩增常见于ALS和额颞叶痴呆（FTD, frontotemporal dementia）患者，目前已知重复基因片段长度从38到约1600不等。在ALS发病机制中，不仅神经元受影响，微胶质细胞（microglia）、星形胶质细胞（astrocytes）等神经胶质细胞也被证明具有重要作用，参与了神经炎症反应。然而，C9orf72 HRE具体如何影响胶质细胞，尤其是微胶质细胞功能，目前尚不清楚。

在ALS中，神经炎症及其细胞机制成为研究热点。既往研究显示，C9orf72主要表达于髓系细胞，尤其是微胶质细胞。动物实验提示，C9orf72的缺失可导致免疫反应异常、髓系细胞增殖增强及溶酶体功能障碍。对于上述基因病变下人类神经胶质细胞具体的变异与应答机制，尤其是遗传型ALS与散发型ALS（sALS, sporadic ALS）的区别，则鲠在前沿。针对上述科学痛点，作者开展了系统研究，试图揭示C9orf72 HRE对ALS患者胶质细胞的分子和细胞机制影响，评估其对微胶质细胞和星形胶质细胞的功能、转录状态以及细胞间通讯的影响，并为今后患者分型及精准治疗提供理论依据。

二、论文来源及作者信息

本论文题为“C9orf72 hexanucleotide repeat expansions impair microglial response in ALS”，发表于《nature neuroscience》2025年11月第28卷。第一作者包括Pegah Masrori、Baukje Bijnens、Laura Fumagalli（均为并列第一），通讯作者为Pegah Masrori、Renzo Mancuso、Philip van Damme。作者主要来自KU Leuven大学、University of Antwerp等欧洲知名神经科学研究机构，体现了多机构协作的研究实力。

三、研究流程详细解读

1. 研究设计与样本采集

本研究采用多层次、系统性设计，融合人类脑脊髓后验组织样本、iPSC衍生细胞模型及小鼠异种移植模型。共纳入ALS患者（包括C9orf72 HRE型与散发型各5例）及健康对照，获取其运动皮层与脊髓组织进行单核转录组测序（single-nuclei RNA sequencing, snRNA-seq）。同时，研究还利用人iPSC衍生微胶质细胞（包括C9orf72重复扩增型、C9orf72敲除及其同源对照）、将其异种移植至免疫缺陷型小鼠脑内，并开展多种功能及分子生物学实验。

a) 后验组织单核测序与细胞亚群分析

研究者通过snRNA-seq技术，系统鉴定了运动皮层和脊髓样本中主要细胞类型及其比例，涉及总计156,252个细胞核。具体细胞类型包括：星形胶质细胞、内皮细胞、神经元、微胶质细胞、少突胶质细胞及其前体，还在脊髓中鉴定出自然杀伤细胞等。在微胶质细胞和星形胶质细胞亚群的分析中，作者结合了外部大数据集（如Gerrits等研究共计132,628个微胶质细胞核），运用聚类与基因标志物等方法，最终识别出多个微胶质细胞亚群（如homeostatic microglia (HM)、transitioning microglia ™、disease-associated microglia (DAM)等），以及星形胶质细胞的六大亚群。

b) 基因表达分析与通路富集

作者重点分析了C9orf72基因在各细胞类型中的表达水平，发现微胶质细胞表达量最高，C9orf72 HRE载体微胶质细胞表达显著下降，证实了C9orf72基因功能丢失（haploinsufficiency，功能半丧失）。在基因表达改变的基础上，研究者进一步运用加权基因共表达网络分析（WGCNA）、基因集合富集分析（GSEA）等算法，对关键通路如溶酶体、吞噬、炎症与能量代谢等功能进行富集评估。

c) 异种移植细胞模型

为验证后验组织发现并排除旁观者机制（如脑微环境影响），研究者分化iPSC得到微胶质细胞前体，包括C9orf72 HRE型、C9orf72敲除型及各自同源对照，通过CRISPR-Cas9技术实现基因编辑。随后将这些人源微胶质前体移植至免疫缺陷小鼠脑内（rag2−/− il2g−/− hcsf1ki），在移植3个月或6个月后通过FACS分选、单细胞RNA测序，分析其细胞状态及反应。

d) iPSC微胶质细胞溶酶体与吞噬功能检测

作者在体外分化人iPSC为微胶质细胞，应用免疫染色/高分辨扩增显微镜监测溶酶体酶（如cathepsin D, CTSD）分布与形态变化。通过电子显微镜及功能性吞噬/降解实验（如Phrodo E. coli颗粒实验），详细分析溶酶体结构、吞噬物质内化与降解能力的变化。

e) 微胶质-星形胶质细胞通讯分析

作者利用CellChat软件，绘制了微胶质细胞与星形胶质细胞之间的配体-受体（ligand-receptor）互动地图，分析不同ALS分型（C9-ALS与SALS）之间的通信方式变化，揭示了影响神经炎症与细胞反应的潜在分子机制。

2. 主要实验结果及其逻辑联系

a) C9orf72 HRE导致微胶质细胞C9orf72表达下降

数据表明，六核苷酸重复扩增仅在微胶质细胞中导致c9orf72表达下降（haploinsufficiency），其他细胞类型不受影响，这与既往血液与iPSC微胶质细胞结果一致。

b) 微胶质细胞疾病应答受损及其分子特征

散发型ALS患者微胶质细胞会向反应性状态转变，表现为升高的炎症、溶酶体和吞噬相关基因表达。然而，C9orf72 HRE患者微胶质细胞则保持更高的HM标志表达，无明显激活/反应性转变。与GRN缺陷病例正相关，说明二者可能有功能重叠。WGCNA分析发现，C9-ALS微胶质应答通路（如溶酶体、凋亡、免疫反应）活性低下，而散发型ALS则相反。

c) 溶酶体-吞噬路径障碍机制验证

异种移植模型结果支持上述发现：C9-HRE型和C9orf72敲除微胶质细胞均难以转化为反应性状态（DAM/HLA），伴随HLA相关基因显著下调，家族型ALS在功能上更接近于缺陷性而非激活型应答。体外实验证明，C9orf72丧失导致CTSD阳性溶酶体增大、密度升高，同时吞噬物质降解效率降低，积累于晚期内体/溶酶体，即溶酶体功能障碍。

d) 星形胶质细胞转录状态差异

星形胶质细胞呈现区域特异性转录异质性，脊髓亚群具有更显著的基因表达变化。SALS星形胶质细胞上调反应性基因（如SERPINA3），而C9-ALS保持更高的homeostatic和发育相关基因表达。微胶质细胞受损可能通过减弱的细胞通讯间接损害星形胶质细胞转变和反应。

e) 微胶质-星形胶质细胞通讯异常及候选分子通路

CellChat分析识别出84组重要的配体-受体对，揭示了ALS分型特异性的细胞通讯改变，例如spp1-cd44轴在散发型ALS中上调（此前已证实与疾病进展相关），而gas6-mertk/axl信号在C9-ALS中特异异常，提示其可能介导微胶质抑制。通讯异常可能在C9-ALS中阻碍胶质细胞的协调响应，成为新的致病机制线索。

四、研究结论与科学价值

本研究首次系统性揭示了C9orf72六核苷酸重复扩增导致ALS患者微胶质细胞c9orf72功能半丧失，抑制了其向疾病相关反应性细胞状态（如DAM/HLA）转变，损害了溶酶体吞噬功能，并伴随细胞通讯障碍。星形胶质细胞也表现出响应受损，支持ALS是一种非细胞自主的多细胞类型疾病。这些分子和细胞机制差异，使家族型C9orf72 ALS与散发型ALS在应答机制和治疗靶点上可能存在本质区别。

此项研究为ALS患者分型、病理机制剖析以及精准治疗（例如基于溶酶体功能或细胞通讯靶点的干预）提供了理论支撑。特别是在家族型ALS临床表现与散发型无异的背景下，揭示微观机制差异具有重要临床价值。

五、研究亮点与创新

• 研究对象多样，方法系统多层次：融合人脑后验组织、iPSC免疫分化模型及小鼠异种移植系统，完美比对体内体外及跨物种结果。
• 高精度单细胞测序与外部大数据集整合：聚类与分型分析精准识别微胶质细胞与星形胶质细胞亚型，数据算法创新。
• 溶酶体功能障碍机制实质性验证：罕见地通过体外扩增显微镜与电子显微镜观察微胶质细胞溶酶体超结构变化，再辅以功能性吞噬实验全面论证。
• 细胞通讯机制图谱首次绘制：CellChat大数据模拟绘制ALS微胶质-星形胶质细胞通讯网络，为后续药物筛选与功能研究奠定基础。

六、论文的应用价值与后续启示

本研究强调微胶质细胞及星形胶质细胞在ALS发病中的主导作用，为分型诊断和分子分层治疗（如溶酶体调控、细胞通讯调节等策略）提供了操作性靶点。研究提示，针对家族型ALS患者的免疫应答激活及胶质细胞功能恢复可能成为未来精准诊疗的方向。

此外，该研究还提出了区域异质性（如脊髓区域胶质细胞亚型特异性基因表达）对病变易感性的贡献，丰富了ALS区域选择性病理机制的理论基础。对于深入探索ALS/FTD、阿尔茨海默症等其他神经退行性疾病的共性与特异，也提供了范例。

七、其他重要信息

作者在论文收录大量补充数据，支持了溶酶体、吞噬信号通路等分子特征的进一步验证。研究还调用多项最新算法（如WGCNA、MILO、CellChat)，并对既有小鼠模型、先前临床cohort及体外细胞系的结果进行了交叉比对，体现了极强的实验严谨性和科学开放性。值得关注的是，论文最后还强调了未来进一步分型、阶段化研究的必要性，为后续多中心大样本研究和药物开发指明了方向。

八、总结

该项发表于《nature neuroscience》的顶级科研工作，首次细致揭示了C9orf72家族型ALS与散发型ALS在微胶质细胞和星形胶质细胞分子、细胞及通讯水平上的重大差异。研究不仅为ALS发病机制建立了新模型，更对疾病分型、分子靶向诊疗以及神经退行性疾病的广义免疫病理研究提供了坚实范例，具有极高的科学及应用价值。