La sécrétion non conventionnelle de Park7 nécessite une livraison lysosomale via l'autophagie médiée par les chaperons et un complexe SNARE spécialisé

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sécrétion non conventionnelle Park7/DJ-1 autophagie complexe SNARE stress oxydatif

I. Contexte de la recherche

La protéine PARK7/DJ-1 associée à la maladie de Parkinson (ci-après PARK7) est une protéine multifonctionnelle jouant un rôle important dans diverses conditions pathologiques telles que les maladies neurodégénératives, le cancer et l’inflammation. Bien qu’elle manque d’une séquence signal N-terminale traditionnelle, PARK7 peut être sécrétée hors des cellules sous stress, avec des niveaux de sécrétion significativement élevés dans le liquide céphalo-rachidien et le sang de patients atteints de diverses maladies. Cependant, les mécanismes précis de sa sécrétion non conventionnelle sont longtemps restés inconnus.

Des études antérieures ont montré que le stress oxydatif induit par la 6-hydroxydopamine (6-OHDA) peut favoriser la sécrétion de PARK7 via une voie autophagique, mais des questions clés demeuraient sans réponse : 1. Le mécanisme moléculaire par lequel PARK7 est transporté sélectivement vers la lumière lysosomale sous stress oxydatif via l’autophagie médiée par les chaperons (CMA) 2. La composition et la fonction du complexe SNARE (Soluble NSF Attachment Protein REceptor) spécialisé dans la sécrétion de PARK7

II. Source de l’article

Cet article a été réalisé par l’équipe de Biplab Kumar Dash et Yasuomi Urano (auteur correspondant) de la Graduate School of Life and Medical Sciences de l’Université Doshisha au Japon, publié dans Proceedings of the National Academy of Sciences (PNAS) 2025, volume 122, numéro 19, DOI : 10.1073/pnas.2414790122.

III. Méthodologie et résultats

1. Validation de la sécrétion non conventionnelle de PARK7 induite par 6-OHDA

Conception expérimentale : - Utilisation de la lignée cellulaire HeLa traitée avec différentes concentrations de 6-OHDA - Culture en milieu sans sérum avant collecte du milieu conditionné - Précipitation des protéines sécrétées par l’acide trichloroacétique et détection par Western blot

Découvertes clés : - Augmentation dose-dépendante de la sécrétion de PARK7 sous 6-OHDA (Fig.1B) - La bafédine A (BFA), inhibiteur de la voie ER-Golgi, n’affecte pas la sécrétion (Fig.1D) - L’ultracentrifugation montre PARK7 exclusivement dans la fraction soluble (Fig.S1A) - L’inhibiteur d’exosomes GW4869 n’altère pas la sécrétion (Fig.S1B)

Conclusion : La sécrétion de PARK7 induite par 6-OHDA est indépendante des voies classiques et des exosomes.

2. Rôle du flux autophagique

Innovation méthodologique : - Système rapporteur tfLC3 : utilisation des marqueurs GFP (pH-sensible) et mRFP (pH-stable) pour distinguer autophagosomes (points jaunes) et autolysosomes (points rouges)

Expériences clés : - Augmentation de la conversion LC3-II et dégradation de SQSTM1/p62 sous 6-OHDA (Fig.2A) - La bafilomycine A1 (BafA1) et la chloroquine (CQ) amplifient l’accumulation de LC3-II (Fig.2B) - tfLC3 révèle une augmentation simultanée d’autophagosomes et d’autolysosomes (Fig.2C)

Validation mécanistique : - L’inhibiteur d’ULK1 (MRT68921) et les cellules FIP200 knockout suppriment la sécrétion (Fig.3A-C) - La rapamycine (inducteur d’autophagie) potentialise la sécrétion (Fig.3D) - Le N-acétylcystéine (NAC, antioxydant) inhibe la sécrétion induite par 6-OHDA (Fig.3E-F)

3. Rôle central de la fonction lysosomale

Innovation technique : - Fractionnement subcellulaire couplé au marquage LAMP1 (Fig.4C) - Analyse de colocalisation immunofluorescente PARK7-LAMP2

Découvertes majeures : - Les inhibiteurs lysosomaux (CQ+NH4Cl) entraînent une accumulation intracellulaire de PARK7 (Fig.4A) - Le knockout de STX17 (essentiel pour la fusion autophagosome-lysosome) inhibe fortement la sécrétion (Fig.4D-E) - En revanche, le knockdown des partenaires SNARE SNAP29/47 n’a pas d’effet (Fig.5)

4. Identification du complexe SNARE spécialisé

Innovation méthodologique : - Prédiction structurale par AlphaFold2 multimer (Fig.S5F-G) - Validation des interactions SNARE par co-immunoprécipitation (Fig.7G)

Résultats clés : - Le knockdown de Sec22b (R-SNARE) inhibe la sécrétion (Fig.7B) - Le double knockdown de STX3/4 (Qa-SNARE membranaire) bloque complètement la sécrétion (Fig.7C) - Les knockdowns de Vti1b (Qb-SNARE) et STX8 (Qc-SNARE) inhibent significativement la sécrétion (Fig.7E-F) - La 6-OHDA favorise la formation du complexe SNARE (Fig.7G)

5. Mécanisme de translocation via CMA

Découverte innovante : - PARK7 contient 4 motifs KFERQ-like conservés (Fig.S6D) - Les mutations dirigées identifient les sites 91⁄92, 94⁄95 et 44⁄45 comme critiques (Fig.8B-C) - Les knockdowns de Hspa8 et LAMP2 inhibent la sécrétion (Fig.8D) - Les expériences de réticulation révèlent que PARK7 sécrétée est majoritairement monomerique (Fig.8F)

IV. Conclusions et implications

Cette étude élucide pour la première fois : 1. Mécanisme moléculaire : La 6-OHDA induit la monomerisation de PARK7 via le stress oxydatif, exposant les motifs KFERQ-like pour leur translocation vers les lysosomes via la voie CMA (Hspa8-LAMP2) 2. Voie de sécrétion : Un complexe SNARE spécialisé (STX3/4-Vti1b-STX8-Sec22b) médie la fusion des autolysosomes sécrétoires avec la membrane plasmique 3. Innovation conceptuelle : Proposition d’un nouveau paradigme de “sécrétion médiée par les autolysosomes sécrétoires”

Valeur scientifique : - Fournit une explication mécanistique à la sécrétion anormale de protéines dans les maladies neurodégénératives - Révèle un nouveau rôle de la CMA dans la sécrétion protéique - Identifie des cibles moléculaires pour moduler thérapeutiquement la sécrétion de PARK7

V. Points forts

  1. Innovation méthodologique : Intégration de l’imagerie cellulaire en temps réel (tfLC3), de la prédiction structurale AlphaFold2 et de la spectrométrie de masse avec réticulation
  2. Avancée mécanistique : Premier lien établi entre la voie CMA et les mécanismes de fusion membranaire médiés par SNARE
  3. Signification clinique : Ouvre de nouvelles perspectives pour le développement de biomarqueurs et traitements dans la maladie de Parkinson

VI. Autres découvertes

  • Le knockdown de TMED10 augmente paradoxalement la sécrétion de PARK7 (Fig.8A), suggérant une voie régulatrice inconnue
  • Les tests de perméabilité lysosomale (LMP) montrent que la 6-OHDA ne compromet pas l’intégrité lysosomale (Fig.6)
  • L’inhibition du protéasome n’affecte pas la sécrétion (Fig.S4), confirmant la spécificité de voie