遺伝性難聴の効率的かつ標的型遺伝子治療のための聴覚損失遺伝子のエンハンサーの解読

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学術的背景

遺伝性難聴は、世界で最も一般的な感覚障害の一つであり、4億人以上に影響を及ぼしており、そのうち約60%の先天性難聴は遺伝的要因に関連しています。アデノ随伴ウイルス（AAV）を介した遺伝子治療は、遺伝性難聴の治療において大きな可能性を示していますが、その特異性と安全性には依然として重要な問題が残されています。蝸牛の構造の複雑さは、遺伝子送達の正確性をさらに困難にしています。これらの問題を解決するために、研究者たちは、難聴遺伝子のエンハンサーを解析するための新しいワークフロー——AAVレポーター遺伝子に基づく体内転写エンハンサー再構築（ARBITER）——を開発しました。この研究は、エンハンサーの識別とエンジニアリングを通じて、効率的かつ特異的な遺伝子治療を実現し、聴力機能を回復することを目的としています。

論文の出典

この論文は、Simeng Zhao、Qiuxiang Yang、Zehua Yuらによって共同執筆され、上海科技大学iHuman研究所、生命科学技術学院、および中国科学院昆明動物研究所などの機関から発表されました。論文は2025年5月21日に『Neuron』誌に掲載され、タイトルは『Deciphering Enhancers of Hearing Loss Genes for Efficient and Targeted Gene Therapy of Hereditary Deafness』です。

研究のプロセス

1. ARBITERワークフローの確立

研究チームはまず、ARBITERワークフローを確立しました。このワークフローは、AAV-IEベクターを使用して、合成遺伝子制御要素を含むレポーター遺伝子を蝸牛に送達します。これらの要素が遺伝子発現に必要である場合、AAVベクターが運ぶレポーター遺伝子は、標的遺伝子と同様の発現パターンを示します。研究者たちは、新生マウスの蝸牛にAAV-IEレポーター遺伝子を円窓注射（RWI）によって送達し、2週間後に組織を回収して免疫蛍光染色を行いました。結果、AAV-IEベクターとCAGプロモーターを組み合わせることで、蝸牛細胞を効率的にトランスデュースし、ほぼ100%の有毛細胞（HCs）と80%-95%の支持細胞（SCs）がトランスデュースされました。

2. エンハンサーの識別と検証

研究者たちは、以前に発表されたATAC-seqおよびChIP-seqデータセットを分析し、標的遺伝子近傍のオープンクロマチン配列と転写因子結合配列を識別しました。さらに、ゲノムブラウザを使用して、遺伝子座内の保存された非コード要素（CNEs）を分析し、100bpを超えるCNEsを候補エンハンサーとして選択しました。これらの要素に基づいて、研究者たちは一連のレポーター遺伝子構築体を設計し、AAV-IEベクターを使用して新生マウスの蝸牛に送達しました。結果、SLC26A5遺伝子座内の2つのCNEs（SLC26A5-e1およびe2）が、SLC26A5の発現を協調的に制御することが示されました。

3. エンハンサーの機能検証

これらのエンハンサーの機能を検証するために、研究者たちはCRISPR-Cas9を介した遺伝子編集技術を使用して、SLC26A5-e1ノックアウトマウスおよびSLC26A5-e1 + e2ダブルノックアウトマウスを作成しました。表現型特性分析により、SLC26A5-e1ノックアウトは、マウスの成熟過程においてprestinの発現が徐々に減少することを示し、SLC26A5-e1 + e2ダブルノックアウトはprestinの発現を完全に消失させ、重度の難聴を引き起こすことが明らかになりました。

4. エンハンサーのエンジニアリングと最適化

SLC26A5-e1 + e2エンハンサーの発現効率の低さを克服するために、研究者たちはARBITERワークフローを使用してエンハンサーを最適化しました。彼らはe1およびe2エンハンサーを小さなモジュールに分割し、一連の合成エンハンサーを設計しました。結果、e1p3とe2p2またはe2p3モジュールを組み合わせた合成エンハンサー（例えばb8）が、遺伝子発現効率を大幅に向上させることが示されました。研究者たちはさらに、b8エンハンサーを使用したSLC26A5ノックアウトマウスにおける治療効果を評価し、b8を介したSLC26A5の送達がマウスの聴力機能を効率的に回復させることを確認しました。

主な結果

  1. ARBITERワークフローの確立：AAV-IEベクターとCAGプロモーターを組み合わせることで、蝸牛細胞を効率的にトランスデュースし、ほぼ100%の有毛細胞と80%-95%の支持細胞がトランスデュースされました。
  2. エンハンサーの識別と検証：SLC26A5遺伝子座内の2つのCNEs（SLC26A5-e1およびe2）が、SLC26A5の発現を協調的に制御することが示されました。
  3. エンハンサーの機能検証：SLC26A5-e1ノックアウトは、マウスの成熟過程においてprestinの発現が徐々に減少することを示し、SLC26A5-e1 + e2ダブルノックアウトはprestinの発現を完全に消失させ、重度の難聴を引き起こすことが明らかになりました。
  4. エンハンサーのエンジニアリングと最適化：e1p3とe2p2またはe2p3モジュールを組み合わせた合成エンハンサー（例えばb8）が、遺伝子発現効率を大幅に向上させ、SLC26A5ノックアウトマウスの聴力機能を成功裏に回復させました。

結論

この研究は、ARBITERワークフローを通じてSLC26A5遺伝子のエンハンサーを成功裏に識別およびエンジニアリングし、効率的かつ特異的な遺伝子治療を実現することで、SLC26A5ノックアウトマウスの聴力機能を回復させました。この研究は、エンハンサーを介した遺伝子発現の基本原理に対する理解を深めるだけでなく、遺伝性難聴の遺伝子治療に対する新しい戦略とツールを提供しました。

研究のハイライト

  1. 革新的な手法：ARBITERワークフローは、難聴遺伝子のエンハンサーを迅速かつ信頼性高く解析するための新しい手法を提供しました。
  2. 効率的なエンハンサーエンジニアリング：エンハンサーモジュールの最適化を通じて、研究者たちは効率的かつ特異的なエンハンサーb8を開発し、遺伝子発現効率を大幅に向上させました。
  3. 治療の可能性：b8エンハンサーを介した遺伝子治療は、SLC26A5ノックアウトマウスの聴力機能を成功裏に回復させ、遺伝性難聴治療におけるその応用可能性を示しました。

その他の価値ある情報

この研究では、b8エンハンサーの成体マウスにおける治療効果も評価しました。結果、b8は外有毛細胞（OHCs）を特異的にトランスデュースし、聴力機能の障害を引き起こさないことが示されました。この発見は、b8エンハンサーの臨床応用に対するさらなる支持を提供します。

この研究を通じて、私たちはエンハンサーを介した遺伝子発現の基本原理に対する理解を深めるだけでなく、遺伝性難聴の遺伝子治療に対する新しい戦略とツールを提供しました。