異常スプライシングがALS/FTDにおけるC9orf72リピート拡大のエクソン化を引き起こす

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異常スプライシング C9orf72 リピート拡大 ALS 前頭側頭葉認知症 DPRタンパク質 治療標的

Nature Neuroscience最新研究がALS/FTD関連C9orf72病因メカニズムの新たな経路を解明

学術的背景と研究動機

筋萎縮性側索硬化症（ALS, Amyotrophic Lateral Sclerosis）と前頭側頭型認知症（FTD, Frontotemporal Dementia）は、臨床医学において最も課題の多い神経変性疾患であり、その発病機構は複雑で未だ十分に解明されていません。近年、染色体9番のオープンリーディングフレーム遺伝子C9orf72の第1イントロン領域（intron 1）における6塩基配列リピート拡大（G4C2，ggggcc）は、ALS/FTDで最も一般的な遺伝的原因の1つであることが判明しています。患者では、このリピート数が正常の12以内から数百、さらにそれ以上に増加し、関連疾患の発症率が高まります。

しかし、C9orf72リピート拡大は非コード領域（イントロン領域）に位置し、従来の理論ではイントロンRNAはスプライシング後に分解されるか、核内に留まるため、細胞質へ輸送され翻訳されることは難しいと考えられていました。すでにC9orf72リピート拡大が非AUG依存型機構（repeat-associated non-AUG, RAN translation）によって複数の病因性ジペプチドリピートタンパク質（dipeptide repeat proteins, DPRs）をコードすることは示されていますが、イントロンRNAがどのようにして細胞質へ輸送され翻訳装置にアクセスするかは未解決の疑問として残っていました。この核心的な科学的課題へ、長期に渡り突破的なメカニズム解明はなされていません。

本研究はまさにこの背景のもと、C9orf72イントロン6塩基リピート拡大RNA（NRE, Nucleotide Repeat Expansion）が細胞質翻訳能力を獲得する具体的分子機構の解明を目的とし、RNA加工やスプライシング過程が関与するかどうかの検討を通じて、ALS/FTD治療戦略への新たな標的の可能性を示そうとするものです。

論文情報と著者チーム

本論文のタイトルは「Aberrant splicing exonizes c9orf72 repeat expansion in als/ftd」であり、2025年10月発行の『Nature Neuroscience』第28巻（2034-2043ページ）に掲載され、オンライン公開は2025年8月11日です。著者チームは、米国イェール大学医学部（Yale University School of Medicine）、イェール大学学際神経科学プログラム（Interdepartmental Neuroscience Program）、メイヨークリニック（Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences、Department of Neuroscience）、アラバマ大学バーミンガム校医学部（University of Alabama at Birmingham School of Medicine）など、複数の最先端研究機関から構成されています。通信著者はJunjie U. Guo（junje.guo@yale.edu）です。

研究の詳細手順とイノベーション方法

1. 研究手法と革新的実験手順

1.1 研究対象とグループ分け

本研究では患者由来線維芽細胞（fibroblasts）、誘導多能性幹細胞由来運動ニューロン（iPSC-derived motor neurons, MNs）、および脳組織サンプルなど多様な研究対象を選定しています。サンプルはC9orf72 6塩基リピート拡大患者（c9 nre+）群と非拡大対照（c9 nre–）群に分け、ニューヨークゲノムセンターおよびTarget ALS Consortium共同データベースのヒト脳組織サンプル（c9 nre+：105例、c9 nre–：503例）も含まれます。

1.2 サンプル処理と分子検出手順

研究手順は高い革新性があり、C9orf72 NRE RNAの高感度同定のために独自開発のNREキャプチャーシーケンス技術（nre-capture-seq）を用いています。主要工程は以下の通りです：

  • RNAアンチセンスキャプチャーとシーケンス（ASO-based nre-capture-seq）
    研究チームは5’端生物素標識アンチセンスオリゴヌクレオチド（antisense oligonucleotides, ASOs）をC9orf72 6塩基リピート領域（(ccccgg)3）にデザインし、患者線維芽細胞・運動ニューロン・脳組織から抽出した細胞質RNAとハイブリダイズ。次いで、ストレプトアビジン磁気ビーズでキャプチャし、RNA-DNAハイブリッド体をRNase Hで切断し、目的のNRE RNAを溶出。最後に低インプットRNA-seq用ライブラリーを作製してハイスループットシーケンス。

  • 細胞分画とRT-qPCR
    NRE RNAの核内・細胞質分布を正確に測定するために、サブセルラー分画技術を用いて核および細胞質RNAを分離し、それぞれNRE濃縮・定量PCR解析。

  • 新規スプライス部位検出と解析法
    高感度シーケンスとバイオインフォマティクス手法（STAR、samtools markdup等）により、スプライスアイソフォーム全体と遺伝子座のリード数を定量、異常スプライス部位の使用状況も解析。

  • 機能的介入実験
    siRNA（スプライシング因子やRNA結合タンパク、SRSF1などを標的）とgapmer-antisenseオリゴヌクレオチド（異常スプライスアイソフォームを標的）で介入し、スプライス制御とDPR産物レベルの変化を評価。タンパク質発現はMeso Scale Discovery Sandwich Immunoassaysで高感度定量。

1.3 模擬系構築とスプライス機構モデル実験

  • ルシフェラーゼ二重レポーター系と人工スプライスモデル
    C9orf72（ggggcc）リピート領域を異なる長さでオリジナルのルシフェラーゼレポーター（イントロン有／無）に挿入し、転写・翻訳後の挙動を解析。リピート領域によるスプライスや翻訳効率への影響を検証。更にin vitro転写（IVT）とRNAトランスフェクションで直接的なスプライス効果と輸送・翻訳影響を区別。
  • siRNAスクリーニングと機能因子同定
    既知のNRE RNA結合タンパクを大規模スクリーニングし、異常スプライスの主要メディエーター因子を決定。

2. 主な実験結果とデータ解釈

2.1 NRE RNAキャプチャーとアイソフォームの特徴

nre-capture-seq後、C9orf72 NRE RNAは対象サンプルで著しく富化し、目的遺伝子からのDPR産物が正常対照群よりも1000倍近く増加。対照細胞ではC9座へのリードはほぼ検出されず、非常に低バックグラウンドであり、本技術の特異性と高感度性が証明された。

2.2 異常スプライシングによるNRE領域の“外顕子化”（Exonization）

重要な発見として、C9orf72 6塩基リピート拡大はイントロン1のスプライシング挙動を変化させ、下流の複数異常な5’スプライス部位を活性化し、NRE領域が延長外顕子1に組み込まれることが示された。主要な3つのアイソフォームは異なる5’スプライス部位（ex1b、ex1c、ex1d）を利用するが、共通の3’スプライス部位を使い、細胞質へ輸送・翻訳可能な新規mRNAを生成。このようなアイソフォームはALS/FTDの脳組織で顕著に蓄積し、その生成はスプライシング因子SRSF1によって調節される。

2.3 異常アイソフォームの効率的核外輸送とDPR翻訳鋳型化

核／細胞質分画と定量PCRにより、大部分のNRE“外顕子化”スプライスアイソフォームが効率的に細胞質へ移行し、核内に限定されないことが確認された。正常C9 mRNAの細胞質分布（40-60%）と同等であり、exon 2を標的siRNA処理では、これらアイソフォームがDPR翻訳の効果的な鋳型であること、下流のPolyGA・PolyGPジペプチドレベルが有意に低下することが明らかとなった。

2.4 異常スプライシング挙動の細胞型特異的制御

患者iPSCから分化させた運動ニューロンでは、ex1c–ex2異常スプライスアイソフォームがNRE RNAの主要な形式として分布が顕著に高く、線維芽細胞よりも顕著であることから、スプライス選択に細胞型特異的調節が存在すると示唆された。ex1c–ex2スプライス部位を標的としたgapmer ASOによる介入でDPR産物が顕著に低減し、治療応用可能性が示された。

2.5 大規模ヒト脳組織での異常スプライス機構の検証

ニューヨークゲノムセンター脳組織データの分析では、c9 nre+脳領域（小脳、前頭葉、運動皮質）で異常スプライスアイソフォーム（ex1c–ex2、ex1d–ex2、ex1e–ex2）のレベルが普遍的に上昇し、非NRE患者でも低量ながら異常スプライスが観察され、NRE拡大によりこの機構が強く活性化されるが、非病的な状態でもごくわずか自然発生することが示唆された。

さらにTDP-43核内消失の解析では、これら異常スプライスはその下流効果ではなくNREによる直接作動であることが示された。

2.6 リピート配列長依存のスプライス活性化メカニズム

遺伝子工学ルシフェラーゼレポーターを用いた実験では、ggggccリピート数が病理閾値（>33×）に達することで新規異常5’スプライス部位が強力に活性化されることが判明。スプライスはイントロンの古典的スプライス部位発動効率には影響せず、下流のcrypticスプライス部位の利用を直接促進する。cis制御で内因性トランスクリプトームにはほぼ影響せず、その特異性の高さが示された。

2.7 スプライス因子SRSF1の重要役割

siRNAによる介入スクリーニングにより、SRSF1がNRE異常スプライシングの制御に主要な役割を果たすことが発見されました。そのノックダウンにより、異常スプライスアイソフォームとNRE RNA細胞質輸送、DPR産物が大幅に減少し、C9転写および核内pre-mRNAレベルには影響しません。SRSF1は治療標的として有望で、“外顕子化”を介してNRE RNAの翻訳能力や細胞質輸送促進に寄与する可能性があります。

3. 結論・科学的意義と応用価値

3.1 メカニズム解明

本研究はC9orf72 6塩基リピート拡大が全イントロン保持やスプライス後lariat構造の細胞質翻訳によるものではなく、複数下流異常5’スプライス部位を活性化することでNRE領域を延長外顕子1に取り込み、5’キャップ・スプライス・3’ポリアデニル化を受けた完全なmRNAとして細胞質輸送されて高効率RAN翻訳されることを初めて明らかにしました。スプライス機構はリピート配列長およびSRSF1等スプライス因子の制御を受けます。

3.2 応用・科学的革新価値

  • ALS/FTD治療介入の新たな標的：異常スプライス因子（SRSF1など）や異常スプライスアイソフォームを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドにより、病因性ジペプチドリピートタンパク質を効果的に減少させることが可能で、新しい遺伝子治療戦略の開発に期待できます。
  • スプライス機構分野の理論的進展：遺伝性リピート拡大神経疾患において“外顕子化”が中心的役割を果たすことを初めて明らかにし、他の非コード領域リピート疾患（HD、DM1/2など）メカニズム研究への指針を提供します。
  • 手法の革新と広範な適用性：nre-capture-seqによる希少病関連RNAの高感度キャプチャーは他疾患研究にも応用可能、ASO・siRNA遺伝子介入法の柔軟な対応が評価されています。

3.3 研究のハイライト

  • ALS/FTDの最も一般的な遺伝病因の新たな分子メカニズムを解明し、非コード領域RNAの細胞質翻訳機構という科学的課題を解決。
  • 異常スプライスによる外顕子化メカニズムとその細胞型特異的制御を発見し、臨床での精密治療に道筋を示した。
  • NRE RNAを高効率に標的キャプチャーする新技術を開発し、難検出RNA分子機構解明への新しいルートを切り開いた。
  • SRSF1その他のスプライス因子を新薬開発ターゲットとして提案し、病理分子ネットワークを描出。

その他価値ある情報

  • 本研究は、アンチセンス鎖NRE RNAや他のリピート拡大疾患でも“外顕子化”メカニズムが存在する可能性を示唆し、今後同様の解析技術の開発が必要です。
  • 本研究で利用された主なデータベースや解析手法（STAR、samtools等）は、他の神経遺伝病トランスクリプトーム解析にも参考となります。
  • NREレポーターエンジニアリング実験について、今後RAN翻訳機構解明の際は異常スプライスや他の発現アーティファクトの有無を検証し、結論誤認を避けるよう研究チームは注意喚起しています。

『Nature Neuroscience』2025年発表の本研究は、ALS/FTD関連C9orf72リピート拡大RNAが異常スプライスによって外顕子へ移動し、細胞質輸送と翻訳能力を獲得する分子機構を明確にし、重要な臨床介入標的を提示した、神経遺伝病分野における画期的な進展です。