Perspectives moléculaires sur la reconnaissance de novo de petites molécules par une structure d'ARN intronique

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ciblage de l'ARN reconnaissance de petites molécules cryoEM inhibiteur d'épissage interactions ARN-ligand

Contexte académique

L’ARN, en tant que vecteur d’information génétique et molécule fonctionnelle, a longtemps été considéré comme une cible “indruggable”. Ces dernières années, avec une compréhension approfondie de la biologie structurale de l’ARN, les scientifiques ont commencé à explorer le développement de petites molécules ciblant l’ARN. Cependant, ce domaine fait face à trois défis majeurs :
1. Le manque de règles systématiques pour la reconnaissance ARN-ligand.
2. La difficulté d’obtenir des structures haute résolution de complexes ARN-petites molécules de grande taille.
3. Les méthodes limitées pour cribler des ligands ARN fonctionnels.

Cette étude se concentre sur une structure ARN particulière, le groupe I intron, largement présent dans les champignons pathogènes. En intégrant le criblage à haut débit, la chimie médicinale et la cryo-microscopie électronique (cryo-EM), elle réalise pour la première fois la conception de novo de ligands pour un ARN catalytique de grande taille et sa résolution structurale à haute résolution. Ce travail fournit un modèle important pour le développement de médicaments ciblant l’ARN.

Source de l’article

Cette recherche a été dirigée par l’équipe du professeur Anna Marie Pyle de l’Université de Yale, avec Tianshuo Liu, Ling Xu et Kevin Chung comme premiers auteurs. Les collaborateurs incluent le HHMI et New England Discovery Partners. L’article a été publié le 8 mai 2025 dans la revue PNAS (vol. 122, no. 19), sous le titre “Molecular insights into de novo small-molecule recognition by an intron RNA structure”.

Détails de la méthodologie

1. Mise en place d’une plateforme de criblage à haut débit

Sujet d’étude : L’intron de type group IA1 dans les mitochondries de Candida albicans (c.a.mtlsu).

Méthodes innovantes :
- Développement d’un système de détection par fluorescence utilisant des molecular beacons : reconnaissance spécifique des séquences d’exons liées par auto-épissage, permettant une surveillance en temps réel de l’activité d’épissage.
- Criblage initial avec une bibliothèque de composés ciblant l’ARN d’Enamine (~100 000 composés).

Données clés :
- Taux de réussite initial : 0,2 %.
- IC50 du composé principal Z3686288076 : 0,84 μM.
- Analyse cinétique confirmant son inhibition compétitive avec le GMP (Ki = 0,67 μM).

2. Étude des relations structure-activité (SAR)

Optimisation en chimie médicinale :
- Modifications systématiques de la structure tricyclique (cycles A/B/C) du composé principal.
- Évaluation de l’activité par des tests d’épissage utilisant des isotopes radioactifs.

Découvertes majeures :
- La stéréochimie et la structure cyclique du cycle B ne sont pas essentielles (composés 9-10).
- L’amine primaire terminale est un pharmacophore clé (perte d’activité des composés 7/8/14).
- L’atome N1 du cycle A est indispensable (activité réduite de 200 fois pour le composé 16).
- Le squelette 2-aminopyrimidine est central pour la reconnaissance (composé 23 inactif).

Résultats de l’optimisation :
- Simplification avec le composé 11 (remplacement du cycle B par de l’éthylènediamine), améliorant l’activité à 0,21 μM.
- Meilleur composé 17 avec un IC50 de 86 nM.

3. Résolution structurale par cryo-EM

Préparation des échantillons :
- Construction d’un mutant A9U pour stabiliser l’hélice P1.
- Préparation des complexes ARN-ligand dans des conditions avec Mg²⁺ ou Ca²⁺.

Acquisition des données :
- Microscopie électronique Titan Krios 300 kV.
- Détecteur direct Falcon 4i.
- Volume total de données : 16 185 images (Ca²⁺) et 8 983 images (Mg²⁺).

Résolution structurale :
- Traitement avec cryoSPARC 4.4.1.
- Résolution locale atteignant 2,25 Å (région de liaison du ligand).
- Q-score du ligand : 0,79 (valeur attendue : 0,65 à 2,5 Å).

Principales découvertes

1. Mécanismes moléculaires de reconnaissance du ligand

Mimétisme de base :
- La 2-aminopyrimidine mime la guanine, formant un triple de bases avec G154:C258.
- L’amine terminale forme un réseau électrostatique avec les phosphates de A152/A253 (distance < 3 Å).

Plasticité des ions métalliques :
- Le métal catalytique Mc est absent en raison des changements géométriques induits par le ligand.
- Le métal structural Me forme une liaison hydrogène via une molécule d’eau avec l’azote pontant du ligand.
- Explique la perte d’activité du composé 13 (remplacement de N par S).

2. Réponse dynamique de la conformation de l’ARN

Mécanisme de gating par ωG :
- Le nucléotide ωG (G316) en extrémité d’intron forme un triple de bases non canonique.
- Effet stérique stabilisant la liaison du ligand.

Déplacement de l’hélice P1 :
- Le phosphate du site d’épissage se déplace de 4,6 Å.
- Formation d’une triple hélice avec l’exon 5’.
- Base structurale de l’inhibition de l’épissage.

3. Modules structuraux uniques

Rôle structural de P7ext :
- Le pseudonœud P11 stabilise la connexion P7ext-P6.
- Motifs A-minor médiant des interactions à longue distance P7ext-P9.1.
- Plateforme d’empilement de bases non canoniques à quatre brins (P3/P7/P7ext/J8-7).

Conclusions et valeur de l’étude

Importance scientifique

  1. Principes de conception ciblant l’ARN : Établissement de l’aminopyrimidine-éthylènediamine comme pharmacophore universel.
  2. Mécanismes dynamiques de reconnaissance : Révélation de la plasticité des ions métalliques et des conformations d’ARN pour une reconnaissance spécifique.
  3. Percée en biologie structurale : Première résolution à 2,4 Å d’un complexe ARN-petite molécule de grande taille.

Valeur appliquée

  1. Développement d’antifongiques : Conception d’inhibiteurs spécifiques ciblant les introns group I conservés chez les champignons pathogènes.
  2. Plateforme de ciblage de l’ARN : Établissement d’un workflow complet du criblage à la résolution structurale.
  3. Support pour la biologie computationnelle : Fourniture de modèles de haute qualité pour la prédiction de structures d’ARN et le criblage virtuel.

Points forts de l’étude

  1. Innovation méthodologique : Première application de la cryo-EM pour la résolution haute résolution de complexes ARN-petites molécules.
  2. Perspective dynamique : Capture des changements de coordination des ions métalliques et des conformations d’ARN en réponse aux ligands.
  3. Valeur translationnelle : Démonstration de la faisabilité d’une conception rationnelle de médicaments ciblant l’ARN fonctionnel.