ウサギ誘導多能性幹細胞由来の間葉系幹細胞による創傷治癒の促進

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学術的背景と研究動機

近年、幹細胞および再生医学分野は急速に発展しており、幹細胞は多分化能と自己複製能を有するため、組織修復や再生の重要な細胞ソースとなっています。数ある幹細胞の中でも、間葉系幹細胞（Mesenchymal Stem Cells, MSCs）は、動物実験や臨床研究において幅広い組織修復能力を示していることから、特に注目されています。間葉系幹細胞は骨髄、脂肪、歯髄、滑膜、臍帯など様々な動物や組織から得ることができます[2][3][4][5][6][7]。しかし、MSCsの臨床応用には主に二つの課題があります。一つは、体外で分離・増殖しても十分な高品質なMSCsを得ることが困難であり、とくにドナーの年齢が上昇するにつれてMSCの数や機能がさらに低下すること[8]。もう一つは、長期間の体外培養によりMSCsが老化し、分化能低下や機能喪失が生じる問題[9]です。

こうしたMSCsの供給や機能障害の問題を解決するために、誘導多能性幹細胞（Induced Pluripotent Stem Cells, iPSCs）の登場が新たな希望をもたらしました。iPSCsは高い増殖能と多分化能を持ち、リプログラミングによってテロメア短縮、ミトコンドリア機能障害、細胞周期停止などの加齢関連表現型障害が取り除かれます[11][12]。理論的には、iPSCsを特定の分化経路でMSCsへと高効率に誘導できれば、臨床や再生医学分野へ高品質な細胞資源を十分に供給できます[10][15]。ヒトやマウス由来iPSCsを用いた分化研究は比較的進んでいますが、他の種（特にウサギ等の大型動物）におけるiPSCsおよびその由来のMSCの分化メカニズム、特性、応用モデルについては系統的研究が不足しています。これは動物モデル選択、獣医臨床治療の発展、異種間再生医学の進歩に直接影響します。

本研究は上記の背景のもと、ウサギ誘導多能性幹細胞（rabbit iPSCs）から間葉系幹細胞（MSCs）へと高効率で分化させる手法を検討し、信頼できる体外誘導プロトコルの確立と、得られたiPSCs-MSCsのマウス創傷モデルでの創傷治癒促進機能の検証を目的とし、異種間再生医学応用への理論的・実験的根拠を提供しています。

論文の出典、研究チームおよび発表情報

本論文「Rabbit induced pluripotent stem cells-derived mesenchymal stem cells for enhanced wound healing」は、Hsing-Yi Yu、Yang-Zhe Huang、Edward Chernらによって執筆されました。著者らは台湾大学生化科技学系幹細胞・再生医学専門ラボ及び台湾大学発生生物学・再生医学研究センターに所属しています。本論文は2025年にOxford University Press傘下のStem Cells Translational Medicine（stmcls）誌に掲載されました。

研究設計および実験プロセスの詳細

研究全体構成の概要

論文はウサギiPSCsから効率よく間葉系幹細胞へ分化誘導するプロトコルを軸に、a）ウサギiPSCsの培養と分化、b）分化細胞の分子・多能性の検証、c）iPSCs-MSCsの三系統分化能評価、d）iPSCs-MSCsのマウス創傷治癒モデルでの機能検証、という主要実験フローで総合的にデータを取得し、考察を行っています。

1. ウサギ誘導多能性幹細胞の培養と継代

本研究で用いられたウサギiPSCs株（ips-L1）は日本RIKENバイオリソースセンターから提供されました。細胞培養には標準的なKOSR培地（20%ノックアウト血清代替、bFGF、GlutaMAX、非必須アミノ酸、β-メルカプトエタノールなどを含む）を用い、マウス胎児線維芽細胞（MEF）のフィーダー細胞層に播種し、iPSCsが50-60%コンフルエントになった時点で低濃度トリプシン消化後、適切な細胞密度で継代しました。

2. ウサギiPSCsを間葉系幹細胞へと分化させる具体的手順

分化誘導には胚様体（Embryoid Body, EB）形成法とTGF-βシグナル阻害剤SB431542の併用を採用しました。

  • ステップ1：ウサギiPSCsを消化後、非接着性6ウェルプレートに懸濁し球状の胚様体（約1.5×10^5細胞/ウェル）を形成。KOSR培地で10日間培養・定期的に培地交換。
  • ステップ2：胚様体をゼラチンコート培養皿へ移し、10 μM SB431542を添加し間葉系への分化を促進、以降３日毎に培地交換。
  • ステップ3：20日後、胚様体由来の外生細胞を消化して60 mm培養皿で継続培養し、培地中にSB431542を持続的に添加してiPSCs-MSCsを形成。
  • ステップ4：1代目以降、80%コンフルエント毎に消化して1:3の割合で継代、全工程で約27日をかけ、形態・遺伝子・機能すべてで間葉系幹細胞基準を満たすウサギiPSCs-MSCsを獲得しました。

3. 分化細胞の分子および機能的特性の検証

  • 多能性喪失と胚葉分化：RT-PCR、qPCRで分化過程におけるOct4、Sox2、Nanog等多能性遺伝子の段階的消失、胚様体および分化初期細胞中の三胚葉マーカー発現変化を検証し、分化系譜の確認を行いました。
  • 表面分子検出：qPCRでMSCs特異的表面分子（CD44、CD73、CD90、CD105）の発現を評価、分化細胞がMSCsの典型表現型を獲得したことを証明。同時にCD34、CD45等造血幹細胞マーカーの発現は完全に消失しており、高純度であることが示されました。
  • ウサギ由来脂肪間質幹細胞との比較：iPSCs-MSCsのMSC特異的分子発現レベルはいずれもウサギ由来ADSCより高く、プロトコルの有効性が確認されました。

4. 体外での三系統分化能評価

骨・脂肪・軟骨への三方向分化をそれぞれ評価しました。

  • 骨分化：分化細胞を骨分化誘導液に曝露し、アリザリンレッド染色でカルシウム沈着を検出。qPCRでALP、Runx2等骨分化関連遺伝子発現を確認し、骨形成能を証明。
  • 脂肪分化：分化細胞を脂肪分化誘導液に移し、オイルレッドO染色で脂肪滴形成を観察。FABP4、PPARγ等の脂肪分化関連遺伝子発現も測定し、高い脂肪分化能を示しました。
  • 軟骨分化：高密度マイクロマス培養法を用い、アルシアンブルー染色でヒアルロン酸やプロテオグリカンの集積を観察。Col2A1、ColXA1、Sox9、Acan等軟骨関連遺伝子の著明な発現上昇を検出しました。

5. ウサギiPSCs-MSCsのマウス創傷治癒促進体内実験

免疫不全ヌードマウスの全層皮膚欠損（5 mm）モデルを使い機能検証を実施。実験群は傷口局所にMatrigel基質で包埋したiPSCs-MSCsを直接注入し、さらに環状にMSC懸濁液も少量注射。対照群にはPBSのみ注入。傷口の大きさを0、3、7、10日で撮影・計測し、ImageJで定量解析。結果、iPSCs-MSCs群は3日目と10日目ともに有意に創傷治癒を促進（P<0.05）。すべての動物実験は国際的倫理基準に則り承認されています。

主な実験結果とデータの根拠

  1. ウサギiPSCsはEB形成能と三胚葉分化能を備え、SB431542誘導プロトコルにより間葉系への高効率な分化が可能。BMP4など間葉系マーカーの有意な発現上昇、外胚葉・内胚葉マーカーの発現抑制を確認。
  2. プロトコルにより得られたiPSCs-MSCsは、表面分子型やウサギADSCと同等であり、陽性・陰性マーカー遺伝子の動態発現からも未分化iPSCの混入が排除され、MSC系統への純化が実現できた。
  3. 体外分化能において、iPSCs-MSCsは三方向分化の各種機能遺伝子が数十倍から千倍以上発現し、組織染色でも顕著な分化結果を示した。
  4. 創傷修復動物実験ではiPSCs-MSCs移植群が傷口の閉鎖速度・治癒品質ともに対照群より優れ、実際の体内機能を証明。動物の安全性についても移植後2か月間腫瘍や異常増生は認められず、生物学的安全性を支持する。

研究の結論、科学的・応用的意義

本研究は、ウサギiPSCsから機能的MSCへの高効率・高信頼プロトコルを確立し、TGF-βシグナル阻害剤（SB431542）が異種間MSC誘導に広く応用可能で高効率であることを示しました。得られたiPSCs-MSCsは体外での古典的三方向分化能を示し、マウス創傷モデルにおいて有意な創傷治癒促進効果を発揮しました。論文ではさらに他動物モデルと比較し、ウサギがヒトに近い優れた再生医療・疾患モデル動物である特長についても論証し、今後の幹細胞治療や個別化医療の発展の基盤となることを強調しています。

また、細胞治療の潜在的腫瘍化リスクに関し、2か月間の体内安全性観察で移植部位に腫瘍形成が確認されなかったことは、今後の細胞移植プレクリニカル安全性評価にも新たな指針を提供します。

研究のハイライトとイノベーション

  • EB形成とSB431542誘導を組み合わせた新規・高効率ウサギiPSCs-MSCs分化プロトコルを構築・最適化し、異種PSCsのMSC誘導に新しい参照モデルを提供。
  • ウサギiPSCsのMSC分化における分子スペクトルや機能特性、および伝統的ADSCとの性能差を初めて系統的に解明し、幹細胞生物学における種間比較データを豊富に提供。
  • ウサギiPSCs由来MSCを用いた異種間（ウサギ→マウス）創傷治癒モデル検証を初めてブレークスルー的に行い、MSCの異種組織修復効果と安全性を強力に裏付け、今後の大型動物・臨床応用に基盤を提供。
  • ウサギiPSCsのMSC分化過程におけるSB431542への高感受性と脂肪分化傾向という新発見により、TGF-βシグナル制御に関する多能性幹細胞分化メカニズムの理解を拡張した。

研究の限界と展望

著者は、今回の創傷治癒実験がウサギiPSCs-MSCsをヒト-マウス異種体内で適用したものであり、機能の最終検証には自家または同種動物モデルでの応用拡張が不可欠であるとしています。今後、iPSCs-MSCsと損傷部位の微小環境との分子相互作用の更なる解明や、長期安全性評価、慢性疾患モデルへの展開も推進予定です。

総括と意義

本研究は動物間葉系幹細胞誘導や機能応用分野において体系的なブレークスルーを成し遂げました。ウサギ等高等動物モデルの幹細胞治療や獣医臨床への技術的基盤を提供したのみならず、ヒトiPSCs-MSCsの大規模生産や適合移植、個別化再生医療推進にも新たな道を切り開いています。論文の分析フローや多層的データは極めて高い基準で設計され、内容は厳密・論理明快であり、今後の再生医学・モデル動物研究・幹細胞治療の理論的・技術的イノベーションに大きな指針を与えるものです。