線維芽細胞活性化タンパク質-αはCXCL12と相互作用し、カノニカルWntシグナルを不活性化して骨芽細胞分化を制御する

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線維芽細胞活性化タンパク質-α CXCL12 Wnt/β-カテニン経路 骨芽細胞分化 脂肪細胞分化 骨粗鬆症 間葉系前駆細胞

学術研究の背景

世界的な高齢化の進行に伴い、骨粗鬆症（osteoporosis）は公衆衛生を脅かす重大な疾患となっています。この疾患は骨量の減少および骨組織の微細構造の劣化を特徴とし、骨折のリスクが高く、高齢者の生活の質を著しく損ない、多大な医療コストをもたらします。骨粗鬆症は主に骨吸収と骨形成のバランスの崩壊によるものです。現在、骨吸収に関するメカニズムの研究は進んでおり、関連する治療薬も次々と上市されていますが、骨形成異常、特に骨芽細胞分化とその制御メカニズムの理解は依然として不十分であり、新たな治療法の開発を妨げています。そのため、骨芽細胞（osteoblast）の分化を支配する細胞・分子機構の解明は、骨代謝疾患の発症・発展メカニズムの説明や新たな治療標的の発見において重要な意義を有します。

骨髄間質細胞（BMSCs, bone marrow stromal cells）は、骨芽細胞や脂肪細胞など多様な細胞の前駆体です。これらは、特定の微小環境と細胞シグナルの調節の下で、骨芽細胞へ分化して新たな骨形成に関与するか、あるいは脂肪細胞へと変化します。BMSCsの分化運命は、Wnt/β-catenin経路、RUNX2、Osterix、PPARγなど、複数のシグナル経路による精密な調節に依存するとともに、分化傾向の失調も骨粗鬆症などの疾患を引き起こす重要な原因です——例えば脂肪細胞への分化増加は骨芽細胞への分化を抑制し、骨髄脂肪含量が増加し、骨組織機能が間接的に低下します。この過程における分子レベルでの制御機構はまだ完全には明らかでなく、とりわけシグナルネットワーク間の相互作用がどのようにして細胞運命を決定するかは未解明です。

近年、線維芽細胞活性化蛋白α（FAPα, fibroblast activation protein-α）は、細胞表面セリンプロテアーゼ（serine protease）として骨代謝との関連が注目されています。初期の報告によると、FAPは二重の酵素活性（dipeptidyl peptidaseおよびendopeptidase）を持ち、組織修復、腫瘍、炎症などへの関与にとどまらず、骨形成過程を負に調節する可能性が指摘されています。しかし、FAPが骨髄間質細胞の骨形成・脂肪形成分化を直接調節するかどうか、またその過程の分子標的や経路について、これまで体系的かつ直接的なエビデンスはありませんでした。

論文の出典と基本情報

本論文の題名は「Fibroblast activation protein- interacts with cxcl12 to inactivate canonical wnt signaling and regulate osteoblast differentiation」で、Yuan Dong、Xingli Hu、Wei Liu、Yinglong Hao、Jie Zhou、Xiaoxia Li、Baoli Wangらにより執筆されました。著者は天津医科大学楚賢義記念病院・内分泌研究所、および天津医科大学基礎医学院に所属しています。本論文はOxford University Press発行の「Stem Cells」誌（論文番号doi:10.1093/stmcls/sxaf027）に掲載され、2025年6月にadvance-articleコラムとして収録されました。

研究全体のプロセスと詳細な実験方法

本研究は「マウス骨髄間質細胞および骨芽前駆細胞」をモデルに、分子クローニング、遺伝子干渉（siRNA/shRNA）、過剰発現、免疫共沈殿、タンパク質分解、分化機能検出（骨形成・脂肪形成誘導および染色）、ウェスタンブロット、トランスクリプトーム解析（RNA-seq）等の実験手法を組み合わせ、FAPがBMSCs分化過程に与える分子機構を体系的に解明しました。主な実験フローは以下の通りです：

1. 細胞取得と分化モデルの確立

  • 対象とサンプル：3週齢C57BL/6Jマウスを使用し、骨髄間質細胞（BMSCs）を分離。骨芽前駆細胞ラインMC3T3-E1、間葉系細胞C3H10T1/2、マウス骨髄間質細胞St2細胞を利用。
  • 分化誘導：骨形成および脂肪形成誘導剤により、BMSCs・St2・C3H10T1/2細胞をそれぞれ骨芽細胞および脂肪細胞へと分化誘導。
  • 分化評価：アルカリホスファターゼ（ALP）染色と活性測定、アリザリンレッド染色で石灰化を評価し、オイルレッドO染色で脂肪細胞分化を評価。

2. FAP及びその機能操作（Gain-of-function / Loss-of-function研究）

  • 過剰発現実験：pcDNA3.1(+)ベクターでFAP遺伝子発現ベクターを構築し、ポリエチレンイミン系トランスフェクション試薬でSt2、MC3T3-E1、C3H10T1/2等細胞へ導入し、FAP過剰発現モデルを作成。
  • 遺伝子ノックダウン実験：特異的siRNA/shRNAを合成しFAPに対して導入、またはレンチウイルス法にてBMSCsに感染させ、FAPノックダウンを実現。
  • 評価体系：FAP発現変化がBMSCsの骨形成／脂肪形成分化に与える具体的影響をqPCRとウェスタンブロットで骨形成/脂肪形成マーカー遺伝子（RUNX2、Osterix、ALP、Osteopontin、PPARγ、C/EBPα、FABP4、Adipsin等）の発現と共に比較分析。

3. 分子メカニズムの探索

  • バイオインフォマティクスと共沈殿：STRINGデータベースでFAPの潜在的相互作用タンパク質を予測し、CXCL12（C-X-Cモチーフケモカインリガンド12）を主要標的と特定。続いて、共免疫沈降（Co-IP）によりFAPとCXCL12タンパク質との直接結合を実証。
  • タンパク質分解実験：試験管内でリコンビナントタンパク質を用い、FAPがCXCL12タンパク質を直接分解できるか、効率と時間依存性を評価。
  • タンパク質発現制御レベルの確認：FAPの過剰発現またはノックダウン後のCXCL12タンパク・mRNA量を測定し、主たる制御段階がタンパク質レベルであることを明確化。

4. Wnt/β-cateninシグナル経路解析

  • シグナル伝達活性モニタリング：Wnt経路の主要構成要素（リン酸化LRP6、リン酸化GSK3β、非リン酸化β-catenin、TCF7L2等）タンパク発現を検出し、FAP・CXCL12によるWnt/β-cateninシグナル制御様式と分化運命に至る分子連鎖を解明。
  • 化学的阻害/賦活剤と遺伝子ダブルノックダウン研究：GSK3β阻害剤CHIR99021でβ-catenin活性を促進、あるいはβ-catenin・FAP/CXCL12ダブルsiRNA・発現ベクターを併用し、FAP/CXCL12によるWnt/β-cateninシグナルと下流分化作用の直接性を実証。

5. FAP酵素活性の機能検証

  • 活性部位点変異実験：FAPタンパクのS624A点変異を施し、酵素活性喪失型FAP（FSM）を作成。これと野生型FAPでCXCL12タンパク分解および分化調節効果を比較し、酵素活性が本制御軸に不可欠であることを明示。

6. RNA-seq全トランスクリプトーム解析

  • 実験設計：siRNAでFAP・CXCL12をノックダウンしたSt2細胞について全トランスクリプトームシーケンシングを実施し、両者で共通・差分となる制御遺伝子群・シグナル経路を解析。
  • データ解析：KEGGおよびGO機能濃縮解析により、差異経路や分子ネットワークの関係を明らかにし、FAP-CXCL12-Wntシグナル軸の調節ネットワークに対する理解を深化。

主な実験結果の詳細

1. FAP発現と分化運命の関連

  • FAPはBMSCsの骨形成・脂肪形成分化過程で著明に発現上昇し、マウス骨や骨格筋組織で高発現、加齢マウスの骨組織ではFAP発現がさらに増強され、骨代謝疾患との関与が示唆される。

2. FAPがBMSC分化運命へ与える影響

  • 骨形成分化：FAP過剰発現によりSt2、MC3T3-E1等細胞の骨形成分化が明らかに抑制され、ALP染色や石灰化の低下、骨形成関連遺伝子の発現低下が見られた。一方、FAPノックダウン/サイレンシングで骨形成分化が促進。
  • 脂肪形成分化：FAP過剰発現はC3H10T1/2等細胞で脂肪分化を促し、オイルレッドO染色が強まり、脂肪関連遺伝子の発現が上昇。FAPノックダウンでは脂肪分化が抑制。
  • 初代BMSCsでもFAPノックダウンの骨形成促進・脂肪形成減少効果を再現。

3. FAPがCXCL12を標的分解しシグナル経路に影響

  • FAPはCXCL12タンパクと複合体を形成し、直接これを分解。mRNAには影響せず、制御はタンパク質レベルで起こる。
  • in vitroでのリコンビナント体系でも、FAPはCXCL12を有意かつ時間依存的に分解可能。
  • CXCL12はWnt/β-cateninシグナルを賦活し、骨形成分化を促進・脂肪分化を抑制するが、FAP酵素活性喪失型（FSM）はCXCL12分解もBMSC分化調整も行えなかった。

4. FAP・CXCL12とWnt/β-catenin経路の骨・脂肪分化調節

  • FAP上昇でWnt/β-cateninシグナル関連タンパク（p-LRP6、p-GSK3β、非リン酸化β-catenin、TCF7L2）の発現が減少し、骨形成抑制・脂肪分化促進が認められる。FAPダウン/またはCXCL12過剰発現では各シグナルが上昇。
  • CHIR99021によるβ-catenin活性化でFAPによる分化傾向異常が回復し、β-catenin siRNAではFAP/CXCL12の運命制御効果が弱まるか消失。此経路が中心的役割を担うことが実証された。

5. CXCL12がFAPの分化調節に果たす役割と協同関係

  • CXCL12の発現調節はBMSCs分化の決定要素で、ダウンレギュレーションで骨形成が抑制・脂肪形成が促進、アップレギュレーションで逆の効果。
  • CXCL12 siRNAは、FAP siRNAによる骨形成促進・脂肪形成抑制効果を一部逆転できる。
  • 逆に、CXCL12過剰発現はFAP過剰発現により誘導された骨形成抑制・脂肪形成増強効果を一部打ち消す。

6. RNA-seqによるトランスクリプトーム上の制御ネットワークの解明

  • FAP・CXCL12沈黙後にそれぞれ千を超える差異遺伝子が検出され、共通調節経路はNOD様受容体・p53・TLRなどに限定されるが、KEGG解析でWnt/β-catenin経路は主要下流経路として出現せず、FAP/CXCL12によるWntシグナル調節は主に翻訳後段階で進行することが示唆された。

研究の結論と科学的価値

本研究は、FAPがCXCL12タンパクを直接分解し、そのWnt/β-cateninシグナル活性化機能を抑制することで、間葉系前駆細胞の骨形成／脂肪形成運命を鍵となって調節することを明確に示しました。具体的には、FAP上昇でWnt信号が抑制され、BMSCは脂肪細胞への分化が進み骨芽細胞への分化は抑制され、FAP低下で骨形成が誘導・脂肪分化が抑制されました。このシグナル軸の発見により、骨髄脂肪と骨形成の「相反関係」の分子機序説明へ新たな展望が与えられると同時に、骨粗鬆症など代謝性骨疾患の治療ターゲットとしてFAP抑制が有望であることが明らかになりました。

研究のハイライト

  1. メカニズムの新規性：初めてFAPがCXCL12を直接加水分解してWnt/β-cateninシグナルとBMSC分化運命制御全体の機構を明らかにし、FAPの骨形成調節への直接的証拠の空白を埋めた。
  2. 手法の厳密さ：細胞実験、試験管内タンパク反応、動物組織評価、分化染色、分子相互作用、シグナル解析、全トランスクリプトーム解析など多角的・複合的アプローチを採用し、結論に高い信頼性を持たせている。
  3. プロテアーゼ活性の必須性：部位特異的変異により、酵素活性がCXCL12分解・機能調節に不可欠であることを証明し、特異的FAP阻害剤設計の指標となる。
  4. 潜在的な臨床価値：FAPまたはCXCL12を標的とすることが、骨髄「脂肪―骨」バランス改善・骨粗鬆症の予防や治療の新展開につながる可能性を示唆。

その他の価値ある内容

  • 本研究は、FAP関連経路の調整やトランスクリプトーム変動がWnt経路を超える範囲まで及ぶことを示し、骨・脂肪代謝により広範な影響を与える可能性を指摘。
  • 研究チームは以前、ヒストン脱メチル化酵素KDM7AがFAP転写を制御し骨恒常性に作用することを発見し、エピジェネティクスと酵素制御が骨代謝軸で強調的に働くことを提示、骨生物学ネットワークの理解を拡大している。

結語と意義

本研究は、FAP-CXCL12-Wnt/β-cateninという新しいシグナル軸が骨髄間質細胞分化決定の架け橋として機能することを明らかにし、骨代謝疾患の基礎メカニズム、標的検証、創薬へ全く新しい道筋をもたらしました。今後、動物モデルや臨床サンプルで本軸の生理・病理的意義がさらに証明されれば、骨生物学の理論体系を大きく豊かにし、骨粗鬆症等の関連疾患の基礎およびトランスレーショナル医学研究を推進することでしょう。