研究背景与问题提出

遗传性叶酸吸收不良 (Hereditary Folate Malabsorption, HFM) 是一种罕见的常染色体隐性遗传病，主要表现为肠道对叶酸的吸收障碍以及脑脊液中叶酸转运受阻。这种疾病是由于编码质子偶联叶酸转运蛋白（Proton-Coupled Folate Transporter, PCFT-SLC46A1）的基因发生功能丧失突变引起的。了解这些突变对PCFT结构和功能的影响对于揭示HFM的病理机制至关重要。

近年来，通过冷冻电镜技术获得了鸡源PCFT（Gallus Gallus PCFT, GPCFT）的高分辨率结构，其与人类PCFT（Human PCFT, HPCFT）具有58%的序列同源性。这为研究HPCFT的功能缺陷突变提供了新的契机。此前的研究主要依赖于基于其他SLC转运蛋白模板的同源建模，但这些模型不足以详细研究突变蛋白的结构变化。因此，研究人员希望通过分子动力学模拟来深入探讨这些突变对HPCFT结构和功能的具体影响，并探索补偿性突变恢复功能的机制。

论文来源及作者信息

该论文由Prithviraj Nandigrami、I. David Goldman 和 Andras Fiser撰写，他们分别来自艾伯特·爱因斯坦医学院的系统与计算生物学系、生物化学系以及医学、肿瘤学和分子药理学系。论文发表在《Journal of Biological Chemistry》上，接收日期为2024年8月4日，修订日期为2025年1月17日，DOI为https://doi.org/10.1016/j.jbc.2025.108280。

研究流程与实验方法

1. 同源建模与分子动力学模拟

1.1 模型构建

研究人员基于GPCFT的冷冻电镜结构（PDB ID: 7BC7 和 7BC6），使用Modeller程序构建了HPCFT的同源模型。GPCFT结构包括结合抑制剂（pemetrexed-bound）和未结合抑制剂（inhibitor-free）两种形式，它们之间的全原子均方根偏差（RMSD）小于0.5 Å。所有模型均经过优化处理，包括缺失原子的补充、末端封端以及二硫键的建模。

1.2 分子动力学模拟

所有模型均嵌入磷脂双分子层并在水箱中进行模拟。模拟条件包括：TIP3P水模型、KCl盐浓度0.15 M、周期性边界条件（PBCs）、粒子网格Ewald（PME）近似处理长程相互作用等。每个模型进行了至少1.5微秒的模拟，生成了约10,000个代表性快照用于后续分析。

2. 结构特征监测

2.1 孔径变化

研究人员使用HOLE程序计算了各HPCFT变体的孔径平均半径，以评估孔径大小的变化。结果显示，所有导致HPCFT功能丧失的单点突变（如F392V、S196L、F392D）均显著增大了孔径（p值分别为0.0001、0.0025、0.0007）。而引入补偿性突变（如F392V/S196L、F392D/G305L）后，孔径恢复到接近野生型水平（p值分别为0.242和0.335）。

2.2 构象动力学

为了评估不同突变对TM螺旋构象的影响，研究人员分析了TM4和TM10的构象聚类情况。野生型和功能性双突变体（如F392M、F392V/S196L、F392D/G305L）的构象聚类数目较少（3.5-5），而功能丧失的单突变体则表现出更高的多样性（3-4倍）。此外，功能丧失突变体的主导构象占总构象的比例较低（29-33%），表明其结构更为无序。

2.3 溶剂可及表面积变化

研究人员还评估了溶剂可及表面积（SASA）的变化。结果显示，功能丧失的单突变体（如F392V、S196L、F392D）的SASA显著减少（p值<0.0001），而引入补偿性突变或保持功能的单突变体（如F392M）的SASA与野生型无显著差异（p值分别为0.3242、0.7364、0.0063）。

2.4 次级结构含量变化

研究人员使用DSSP程序计算了各TM螺旋的次级结构含量。结果显示，所有TM螺旋的螺旋结构含量均有显著减少（10-20%），而在引入补偿性突变后，这些螺旋结构得到了恢复。

2.5 残基接触分析

研究人员利用InterCAAT程序分析了Phe392与其他残基的长程接触情况。结果显示，功能丧失突变体（如F392V、F392D）中的长程接触显著减少，而引入补偿性突变后，这些接触得以恢复。

3. 其他突变体的分析

研究人员还分析了另一个位于不同区域的功能丧失突变体D109A，发现其同样导致孔径增大（增加1.0 Å），并与F392V类似，表现出溶剂可及性的降低。

主要研究结果

1. 功能丧失突变导致孔径增大和结构失稳

研究表明，功能丧失突变（如F392V、S196L、F392D）导致孔径显著增大，伴随内核TM螺旋的结构失稳和溶剂可及性的降低。这些变化使得叶酸底物的传输路径变得不稳定，从而导致运输功能丧失。

2. 补偿性突变恢复功能

引入补偿性突变（如F392V/S196L、F392D/G305L）后，孔径恢复到接近野生型水平，内核TM螺旋的结构稳定性和溶剂可及性也得到改善，从而使运输功能得以恢复。

3. D109A突变的影响

位于不同区域的D109A突变同样导致孔径增大和溶剂可及性降低，进一步证实了这些突变对HPCFT结构和功能的影响具有普遍性。

研究结论与意义

1. 科学价值

本研究通过分子动力学模拟揭示了HPCFT功能丧失突变导致孔径增大、结构失稳的具体机制，并发现了补偿性突变恢复功能的机制。这些发现不仅加深了对HPCFT结构和功能的理解，也为未来开发针对HFM的治疗策略提供了理论依据。

2. 应用价值

研究结果有助于开发新型药物，特别是针对HFM患者的个性化治疗方案。此外，研究中使用的分子动力学模拟方法也可应用于其他SLC超家族转运蛋白的研究，为理解相关疾病的分子机制提供新的思路。

3. 研究亮点

重要发现

• 揭示了功能丧失突变导致孔径增大和结构失稳的具体机制。
• 发现了补偿性突变恢复功能的机制。

方法创新

• 使用GPCFT的冷冻电镜结构作为模板，构建了高质量的HPCFT同源模型。
• 通过分子动力学模拟详细分析了突变对HPCFT结构和功能的影响。

特殊性

• 研究对象为罕见病HFM，具有重要的临床意义。
• 结合多种实验方法（如分子动力学模拟、溶剂可及表面积分析、次级结构含量分析等），全面解析了突变对HPCFT的影响。

本研究为理解HPCFT的功能丧失突变及其补偿性突变提供了新的视角，具有重要的科学和应用价值。