解密听力损失基因增强子以实现高效靶向基因治疗遗传性耳聋

2025-05-02 Fri
学术背景遗传性耳聋是全球范围内最常见的感官障碍之一，影响着超过4亿人，其中约60%的先天性耳聋与遗传因素有关。尽管腺相关病毒（AAV）介导的基因治疗在治疗遗传性耳聋方面显示出巨大潜力，但其特异性和安全性仍存在显著问题。耳蜗结构的复杂性进一步增加了基因递送的精确性挑战。为了解决这些问题，研究人员开发了一种新的工作流程——基于AAV报告基因的体内转录增强子重建（ARBITER），用于解析听力损失基因的增强子。这一研究旨在通过识别和工程化增强子，实现高效且特异性的基因治疗，从而恢复听力功能。
论文来源这篇论文由Simeng Zhao、Qiuxiang Yang、Zehua Yu等作者共同撰写，来自上海科技大学iHuman研究所、生命科学与技术学院，以及中国科学院昆明动物研究所等机构。论文于2025年5月21日发表在《Neuron》期刊上，题为《Deciphering Enhancers of Hearing Loss Genes for Efficient and Targeted Gene Therapy of Hereditary Deafness》。
研究流程1. ARBITER工作流程的建立研究团队首先建立了ARBITER工作流程，该流程利用AAV-IE载体将含有合成基因调控元件的报告基因递送到耳蜗中。如果这些元件确实对基因表达是必要的，AAV载体携带的报告基因将表现出与目标基因相似的表达模式。研究人员通过圆窗注射（RWI）将AAV-IE报告基因递送到新生小鼠的耳蜗中，并在两周后收集组织进行免疫荧光染色。结果显示，AAV-IE载体结合CAG启动子能够高效转导耳蜗细胞，几乎100%的毛细胞（HCs）和80%-95%的支持细胞（SCs）被转导。
2. 增强子的识别与验证研究人员通过分析先前发表的ATAC-seq和ChIP-seq数据集，识别了目标基因附近的开放染色质序列和转录因子结合序列。此外，他们还通过基因组浏览器分析了基因位点内的保守非编码元件（CNEs），并选择了长度超过100bp的CNEs作为候选增强子。基于这些元件，研究人员设计了一系列报告基因构建体，并通过AAV-IE载体将其递送到新生小鼠的耳蜗中。结果显示，SLC26A5基因位点内的两个CNEs（SLC26A5-e1和e2）能够协同调控SLC26A5的表达。
3. 增强子的功能验证为了验证这些增强子的功能，研究人员使用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术创建了SLC26A5-e1敲除小鼠和SLC26A5-e1 + e2双敲除小鼠。表型特征分析显示，SLC26A5-e1敲除导致小鼠在成熟过程中逐渐减少prestin的表达，而SLC26A5-e1 + e2双敲除则完全消除了prestin的表达，导致严重的耳聋。
4. 增强子的工程化与优化为了克服SLC26A5-e1 + e2增强子表达效率低的问题，研究人员通过ARBITER工作流程对增强子进行了优化。他们将e1和e2增强子分割成小模块，并设计了一系列合成增强子。结果显示，由e1p3和e2p2或e2p3模块组合而成的合成增强子（如b8）能够显著提高基因表达效率。研究人员进一步评估了b8增强子在SLC26A5敲除小鼠中的治疗效果，结果显示，b8介导的SLC26A5递送能够高效恢复小鼠的听力功能。
主要结果ARBITER工作流程的建立：AAV-IE载体结合CAG启动子能够高效转导耳蜗细胞，几乎100%的毛细胞和80%-95%的支持细胞被转导。
增强子的识别与验证：SLC26A5基因位点内的两个CNEs（SLC26A5-e1和e2）能够协同调控SLC26A5的表达。
增强子的功能验证：SLC26A5-e1敲除导致小鼠在成熟过程中逐渐减少prestin的表达，而SLC26A5-e1 + e2双敲除则完全消除了prestin的表达，导致严重的耳聋。
增强子的工程化与优化：由e1p3和e2p2或e2p3模块组合而成的合成增强子（如b8）能够显著提高基因表达效率，并成功恢复SLC26A5敲除小鼠的听力功能。
结论该研究通过ARBITER工作流程成功识别和工程化了SLC26A5基因的增强子，实现了高效且特异性的基因治疗，从而恢复了SLC26A5敲除小鼠的听力功能。这一研究不仅加深了我们对增强子介导基因表达的基本原理的理解，还为遗传性耳聋的基因治疗提供了新的策略和工具。
研究亮点创新性方法：ARBITER工作流程为快速、可靠地解析听力损失基因的增强子提供了新的方法。
高效增强子工程化：通过优化增强子模块，研究人员成功开发了高效且特异性的增强子b8，显著提高了基因表达效率。
治疗潜力：b8增强子介导的基因治疗成功恢复了SLC26A5敲除小鼠的听力功能，展示了其在遗传性耳聋治疗中的应用潜力。
其他有价值的信息该研究还评估了b8增强子在成年小鼠中的治疗效果，结果显示b8能够特异性转导外毛细胞（OHCs），且不会导致听力功能的损害。这一发现为b8增强子在临床中的应用提供了进一步的支持。
通过这一研究，我们不仅加深了对增强子介导基因表达的基本原理的理解，还为遗传性耳聋的基因治疗提供了新的策略和工具。