异常剪接导致C9orf72重复扩增外显子化在肌萎缩侧索硬化/额颞叶痴呆中的作用

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异常剪接 C9orf72 重复扩增 ALS 额颞叶痴呆 DPR蛋白 治疗靶点

Nature Neuroscience最新研究揭示ALS/FTD相关C9orf72致病机制新路径

学术背景与研究动机

肌萎缩侧索硬化症（ALS, Amyotrophic Lateral Sclerosis）和额颞叶痴呆（FTD, Frontotemporal Dementia）是临床医学中最具挑战性的神经退行性疾病，其发病机制复杂且尚未彻底阐明。近年来，染色体9号开放阅读框基因C9orf72的首内含子区（intron 1）出现六核苷酸重复扩增（G4C2，ggggcc）已被证实是ALS/FTD最常见的遗传致病因素之一。患者的重复数目可由正常的12个以内扩增至百余甚至更多，导致相关疾病高发。

然而，C9orf72重复扩增位于非编码区域（intronic region），传统理论认为内含子RNA在剪接后被降解或滞留于细胞核，难以进入细胞质被翻译。此前虽然有研究证明C9orf72重复扩增能够通过非AUG依赖性机制（repeat-associated non-AUG, RAN translation）编码生成多种致病性二肽重复蛋白（dipeptide repeat proteins, DPRs），但内含子RNA如何获准出口并进入翻译装置是悬而未解的疑问。针对这一核心科学难题，相关领域长期未有突破性机制阐释。

本研究正是在此背景下开展，意在揭示C9orf72内含子六核苷酸重复扩增RNA（NRE, Nucleotide Repeat Expansion）获得细胞质翻译能力的具体分子机制，同时探索是否可由RNA加工或剪接过程介导，进而为ALS/FTD的治疗策略提供新靶点。

论文信息与作者团队

此论文题为“Aberrant splicing exonizes c9orf72 repeat expansion in als/ftd”，发表于《Nature Neuroscience》2025年10月第28卷（2034-2043页），在线发表时间为2025年8月11日。作者团队来自美国耶鲁大学医学院（Yale University School of Medicine）、耶鲁大学跨系神经科学项目（Interdepartmental Neuroscience Program）、梅奥诊所（Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences、Department of Neuroscience）、亚拉巴马大学伯明翰分校医学院（University of Alabama at Birmingham School of Medicine）等多家顶尖研究机构。首席通讯作者为Junjie U. Guo（junje.guo@yale.edu）。

研究流程详解与创新方法

1. 研究方法及创新实验流程

1.1 研究对象与分组

本项研究选用患者来源的纤维母细胞（fibroblasts）、诱导多能干细胞衍生运动神经元（iPSC-derived motor neurons, MNs）、脑组织样本等多类研究对象。样本分为C9orf72六核苷酸重复扩增患者（c9 nre+）组与非扩增对照（c9 nre–）组。样本量包括多例患者信息，且纳入纽约基因组中心与Target ALS Consortium合作数据库中的人类脑组织样本（105例c9 nre+及503例c9 nre–）。

1.2 样本处理与分子检测流程

研究流程高度创新，开发了专属的NRE捕获测序技术（nre-capture-seq），以鉴定难以富集的C9orf72 NRE RNA。核心步骤如下：

  • RNA反义捕获与测序（ASO-based nre-capture-seq）
    研究团队采用5’端生物素标记的反义寡核苷酸（antisense oligonucleotides, ASOs）针对C9orf72六核苷酸重复区（(ccccgg)3），在患者纤维母细胞、运动神经元及脑组织提取细胞质RNA后进行杂交。紧接着，通过链霉亲和素磁珠捕获，RNA和DNA杂合物经RNase H酶切释放目标NRE RNA，最后进行低输入RNA-seq建库与高通量测序。

  • 亚细胞分馏与RT-qPCR
    为准确定位NRE RNA在细胞核与胞质的分布，研究团队实施亚细胞分馏技术，将核与胞质RNA分离后分别进行NRE富集、定量PCR分析。

  • 新型剪接位点检测与分析方法
    运用高灵敏度测序与生物信息算法（包括STAR软件、samtools markdup等），系统分析剪接异构体及基因座读数，定量新异常剪接位点的使用。

  • 功能干预实验
    通过siRNA（靶向剪接因子及相关RNA结合蛋白，如SRSF1）和gapmer-antisense寡核苷酸（靶向异常剪接异构体）干预，评价剪接调控和DPR产物水平的变化。蛋白表达采用Meso Scale Discovery Sandwich Immunoassays进行高灵敏度定量。

1.3 仿真系统构建与剪接机制模型实验

  • Luciferase双报告系统与人工剪接模型
    将不同长度的C9orf72（ggggcc）重复区插入独创的荧光素酶报告载体（包含/不包含内含子），通过转录与翻译后检测，揭示重复区对剪接、翻译效率的影响，并进一步通过体外转录（IVT）与RNA转染实验区分直接剪接效应和运输/翻译影响。
  • siRNA筛选与功能因子鉴定
    大规模筛选已知NRE RNA结合蛋白，确定在异常剪接中起关键作用的介导因子。

2. 关键实验结果与数据阐释

2.1 NRE RNA捕获与异构体特征

应用nre-capture-seq后，C9orf72 NRE RNA在样本中的富集度显著高于正常对照组，目标基因dpr产物升高近1000倍。对照细胞几乎无C9位点读数，背景极低，表明该方法特异性强且敏感高。

2.2 异常剪接导致NRE区“外显子化”（Exonization）

重点发现：C9orf72六核苷酸重复扩增改变内含子1的剪接行为，使其下游多个异常5’剪接位点被激活，导致NRE区被纳入延长的外显子1。三种主要异构体采用不同的5’剪接位点（ex1b、ex1c、ex1d），但均用相同的3’剪接位点，从而产生入胞质、可翻译的新型mRNA。这些异构体在ALS/FTD脑组织中显著积累，而且其产生受剪接因子SRSF1调控。

2.3 异常异构体高效核输出并成为DPR翻译模板

通过核/胞质分馏与定量PCR确认，绝大部分NRE“外显子化”剪接异构体能够有效进入细胞质，不再被限定于核内，且与正常C9 mRNA胞质分布相当（40-60%）。siRNA靶向exon 2实验显示，这些剪接异构体是DPR翻译的有效模板，其下游生产的PolyGA与PolyGP二肽水平显著下降。

2.4 变异剪接行为的细胞类型特异性调控

在患者iPSC分化的运动神经元中，ex1c–ex2异常剪接异构体成为主要NRE RNA形式，分布显著高于纤维母细胞，提示剪接选择存在细胞类型调控。靶向ex1c–ex2剪接位点的gapmer ASO干预可显著降低DPR产物，体现潜在治疗应用前景。

2.5 在大样本人类脑组织中核实异常剪接机制

分析纽约基因组中心脑组织数据表明，c9 nre+脑区（小脑、额叶、运动皮质）异常剪接异构体（ex1c–ex2、ex1d–ex2、ex1e–ex2）水平普遍升高，且部分无NRE患者亦可见低量出现异常剪接，意义在于NRE扩增强力激活该机制，非病理状态下少量自发发生。

进一步通过TDP-43核内丧失分析，证实上述异常剪接不是其下游效应，而是NRE介导的直接事件。

2.6 重复序列长度依赖的剪接激活机制

通过遗传工程luciferase报告载体编程实验证实，随着ggggcc重复数升至病理阈值（>33×），新型异常5’剪接位点的激活效应显著增强。剪接不影响内含子经典剪接位点启动效率，但直接促进下游cryptic剪接点使用，且效应为“cis”调节，对内源性转录组影响极低，说明其特异性强。

2.7 剪接因子SRSF1的关键作用

通过siRNA干预筛选，发现SRSF1在调节NRE异常剪接中居关键地位。其敲低可显著减少异常剪接异构体、NRE RNA胞质输出及DPR产物，不影响C9转录与核内pre-mRNA水平。提示SRSF1是潜在治疗切入点，其功能可能通过“外显子化”机制促进NRE RNA可翻译性、胞质转运。

3. 结论、科学意义与应用价值

3.1 机理阐释

本项研究率先揭示C9orf72六核苷酸重复扩增并非通过全内含子保留或剪接后的lariat环结构进入胞质翻译，而是激活多个下游异常5’剪接位点，将NRE区纳入延长外显子1，使其成为5’帽子、剪接和3’多腺苷酸化后的完整mRNA，方便细胞质输出及高效RAN翻译。剪接机制依赖重复区长度及受SRSF1等剪接因子调控。

3.2 应用及科学创新价值

  • ALS/FTD临床干预新靶点：靶向异常剪接因子（如SRSF1）或针对异常剪接异构体的反义寡核苷酸，可有效降低致病性二肽重复蛋白水平，有望开发成为新型基因治疗策略。
  • 剪接机制领域理论突破：首次明确揭示“外显子化”机制在遗传性重复扩增神经疾病中的核心作用，为其它非编码区重复病（如HD、DM1/2等）机制研究提供参考方向。
  • 方法学创新与广泛适用性：nre-capture-seq实验流程证明高敏捕获稀有疾病相关RNA可应用于其它疾病研究，且ASO、siRNA基因干预方案高度灵活。

3.3 研究亮点

  • 揭示了ALS/FTD最常见遗传病因的新的分子机制，补全了非编码区RNA进入胞质翻译的科学谜团。
  • 发现异常剪接外显子化机制和其细胞类型特异性调控，为临床精细化治疗指明方向。
  • 开发了高效NRE RNA靶向捕获与分析技术，为难检RNA分子机制研究开创新路径。
  • 提出SRSF1及相关剪接因子为全新药物开发靶点，提供病理分子通路图。

其它有价值信息

  • 研究提示在反义链NRE RNA及其它重复扩增疾病中亦存在类似“外显子化”机制，需进一步开发同类分析技术。
  • 本研究所采用的重要数据库及分析流程（如STAR、samtools等算法工具）可供其它神经遗传病转录组分析参考。
  • 对于NRE报告载体工程实验，研究团队提醒未来RAN翻译机制实验需验证是否存在异常剪接或其它表达伪影，避免结论误判。

《Nature Neuroscience》2025年发表的本研究突破性地揭示了ALS/FTD相关C9orf72重复扩增的RNA可以通过异常剪接移入外显子，获得胞质输出与翻译能力，明确了其分子机制，并提出了重要的临床干预靶点，是神经遗传病领域的重大进展。