基因治疗新突破：Repair Drive技术实现肝细胞体内扩增

学术背景

基因治疗是近年来医学研究的热点领域，尤其是针对肝脏疾病的基因治疗，由于肝脏在代谢中的核心作用，成为了研究的重要目标。尽管已有的基因编辑技术如CRISPR-Cas9在基因敲除方面取得了显著进展，但大多数肝脏疾病需要的是基因修复（correction）而非敲除（disruption）。然而，基因修复的效率和精确性在终末分化的肝脏细胞中非常有限，这严重限制了其临床应用。为了解决这一问题，研究团队开发了一种名为Repair Drive的新技术，旨在通过短暂抑制一个必需基因（essential gene），选择性地扩增经过同源定向修复（HDR, Homology-Directed Repair）的肝细胞，从而提高基因修复的效率。

论文来源

这篇论文由Marco De Giorgi及其团队撰写，研究小组成员来自Baylor College of Medicine、Rice University、Alnylam Pharmaceuticals等多个知名研究机构。论文于2025年2月12日发表在Science Translational Medicine期刊上，题为《In vivo expansion of gene-targeted hepatocytes through transient inhibition of an essential gene》。

研究流程

1. 研究设计

研究的核心目标是开发一种能够在体内选择性地扩增经过HDR修复的肝细胞的技术。Repair Drive技术通过短暂抑制一个必需基因Fah（fumarylacetoacetate hydrolase，延胡索酰乙酰乙酸水解酶），使未修复的肝细胞逐渐死亡，而携带修复基因的肝细胞则得以存活并扩增。

2. 实验步骤

a) 基因编辑和siRNA介导的基因抑制

研究团队使用了腺相关病毒（AAV, Adeno-Associated Virus）作为载体，将CRISPR-Cas9系统和修复模板（donor plasmid）导入小鼠肝脏。修复模板包含了不能被siRNA识别的人类Fah基因（human Fah），以及一个治疗性基因（如人因子IX, human Factor IX, FIX）。随后，小鼠被注射靶向小鼠Fah的siRNA（小干扰RNA），以实现对Fah基因的短暂抑制。

b) 肝脏条件化与选择性扩增

通过siRNA的多次注射，研究人员模拟了肝脏的条件化过程。在Fah基因被抑制的情况下，未修复的肝细胞会因为毒性代谢物的积累而死亡，而携带修复基因的肝细胞则能够存活并扩增。研究团队通过荧光标记（如tdTomato）观察修复细胞的扩增情况，并使用数字PCR（ddPCR）和长读长测序（long-read sequencing）技术对基因编辑事件进行定量分析。

c) 高蛋白饮食增强选择压力

为了进一步增加选择压力，研究团队还进行了高蛋白饮食实验，通过增加酪氨酸代谢来加速未修复肝细胞的死亡，从而进一步增强修复细胞的选择性扩增。

d) 长期安全性和基因表达的持续性

为了评估Repair Drive技术的长期安全性和基因表达的持续性，研究团队对小鼠进行了一年的随访，观察肝脏的病理变化、基因表达的持续性以及是否存在肿瘤发生等长期副作用。

3. 数据分析

研究团队使用了多种先进的数据分析方法，包括： - 数字PCR（ddPCR）：定量分析HDR和NHEJ（非同源末端连接，Non-Homologous End Joining）事件的发生频率。 - 长读长测序（long-read sequencing）：对基因编辑事件的详细结构进行分析，区分不同类型的HDR和NHEJ事件。 - 单核RNA测序（snRNA-seq）：分析修复细胞的转录组特征，揭示其在不同肝脏区域中的分布和功能。

主要结果

1. 选择性扩增效果

研究发现，Repair Drive技术能够显著提高HDR修复的肝细胞比例。在健康小鼠中，修复细胞的比例达到了25%，并且治疗性基因（如FIX）的表达量增加了五倍。此外，通过高蛋白饮食，修复细胞的比例进一步增加，达到24.6%。

2. 基因编辑事件的精确性

通过长读长测序，研究团队发现Repair Drive技术显著减少了NHEJ事件的发生率，并且增加了HDR事件的频率。尽管仍然存在一些非预期的基因编辑事件（如AAV基因组的插入），但这些事件并未对修复细胞的功能产生显著影响。

3. 长期安全性与耐受性

在一年的随访中，Repair Drive技术表现出良好的安全性和耐受性。小鼠的肝功能和体重没有明显变化，且未观察到肿瘤发生的迹象。尽管少数小鼠出现了局部的增生性病变，但这些病变并未表现出恶性特征。

研究结论

Repair Drive技术通过短暂抑制必需基因Fah，实现了在体内选择性地扩增HDR修复的肝细胞，显著提高了基因治疗的效率。该技术不仅能够有效增加治疗性基因的表达，还表现出良好的长期安全性和耐受性。这一技术的成功为肝脏疾病的基因治疗提供了新的思路，特别是对于那些需要基因修复而非基因敲除的遗传性疾病。

研究亮点

1. 创新性技术：Repair Drive技术首次通过短暂抑制必需基因，实现了体内选择性扩增修复的肝细胞，解决了HDR在终末分化组织中效率低下的问题。
2. 高效性与精确性：该技术显著提高了HDR事件的频率，减少非预期的NHEJ事件，确保了基因修复的精确性。
3. 长期安全性：一年随访结果表明，Repair Drive技术具有良好的安全性和耐受性，未发现明显的长期副作用。
4. 应用前景广阔：该技术不仅可以用于治疗凝血障碍（如血友病B），还可以扩展到其他需要基因修复的遗传性代谢疾病。

其他有价值的信息

研究团队还开发了一种名为GISA-seq的技术，用于全基因组范围内检测AAV载体的脱靶整合事件。这项技术能够有效识别AAV基因组在宿主基因组中的整合位点，为基因治疗的安全性评估提供了新的工具。

Repair Drive技术的成功为肝脏疾病的基因治疗开辟了新的道路，未来有望广泛应用于临床，为更多遗传性肝病患者带来希望。