细胞角蛋白19阳性细胞在多能基质细胞分泌蛋白诱导的胰岛再生中的作用

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细胞角蛋白19 多能基质细胞 胰岛再生 糖尿病 系谱追踪 胰管内分泌祖细胞

背景介绍

糖尿病，特别是1型糖尿病（type 1 diabetes, T1D），是一种慢性自身免疫性疾病，其主要特征为胰腺β细胞（beta cell）被免疫系统持续破坏，导致患者丧失调控血糖的能力。1型糖尿病的患者通常需要终身注射胰岛素，但长期胰岛素替代并不能完美模拟人体自身胰岛功能，因此患者往往面临严重的血糖波动，并发心血管和肾脏等并发症，生活质量明显下降。尽管目前医疗手段已能帮助患者较好地控制病情，但如何实现胰岛β细胞的再生，从根本上恢复患者的内源性胰岛功能，是糖尿病领域长期以来追求的目标。

近年来，科学家在“Joslin Medalist”研究中发现，部分被诊断为T1D超过50年的患者，胰腺中依然能检测到残存的胰岛素阳性细胞以及C肽（C-peptide）的持续分泌，提示人体可能存在某种内源性β细胞再生机制。然而，由于自身免疫反应持续存在，加之人体胰岛再生的细胞来源和机制尚不明了，如何有效激活并利用内源性再生能力成为了研究的难点和前沿。

在胰腺的发育和修复过程中，已有大量文献提示包括胰腺导管上皮细胞（ductal epithelial cells）、腺泡细胞（acinar cells）、现有β细胞等多种前体细胞可能参与了β细胞的再生。但由于实验动物模型、追踪技术和损伤方式的多样性，对新生β细胞的来源有较大争议。为了进一步解答这些疑问，科学家们开始关注如何通过外源性干预物质刺激或重编程这些潜在原始细胞，促进其向β细胞分化，最终推动胰岛再生。

目前，间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSC）及其分泌的生长因子被认为具有重要的组织修复和免疫调节作用。本研究正是在此基础上，进一步探寻MSC来源的分泌蛋白（conditioned media, CDM），尤其在Wnt信号通路激活条件下，能否诱导和加速胰岛再生，并明确再生β细胞的来源。

论文来源与作者信息

本项研究论文题为“contribution of cytokeratin 19-expressing cells towards islet regeneration induced by multipotent stromal cell secreted proteins”，由Nazihah Rasiwala、Gillian I Bell、Anargyros Xenocostas与David A Hess等人完成。主要完成单位为加拿大Western University的Department of Physiology and Pharmacology、Robarts Research Institute以及London Health Sciences Center的Department of Hematology。该文发表于2025年于Oxford University Press主办的学术期刊，并已通过开放获取（Open Access）发表，允许学术界广泛传播和再利用。

研究流程详述

总体设计

本研究旨在揭示：在MSC分泌物、尤其是Wnt信号通路激活下的条件培养基（Wnt+ CDM）刺激下，表达Cytokeratin 19（CK19）的细胞是否能够贡献于β细胞再生，以及β细胞再生的真实细胞来源。研究采用了胰岛β细胞消融、CDM直接胰腺注射以及遗传谱系追踪等多种先进技术，分为以下主要实验流程：

1. MSC培养及CDM制备

  • MSC来源与培养：取自8位人类供者的骨髓MSC，培养至传代4代，使用AmnioMax™ 培养基并加入15%胎牛血清。
  • Wnt通路激活：通过添加10μM GSK3抑制剂CHIR99021激活Wnt信号。对照组使用DMSO。
  • CDM收集与浓缩：24小时后，分别收集Wnt+ CDM与对照CDM，使用3kDa超滤离心柱浓缩20倍，最终总蛋白浓度定量在0.1-0.25μg/μl，冷冻备用。
  • MSC表型确认：通过流式细胞仪检测CD73、CD90、CD105等MSC标志物，检测CD34、CD45表达低于1%，确保MSC纯度；用ELISA和细胞组分分离证明Wnt信号上调β-catenin 至细胞核。

2. 动物模型建立及细胞谱系追踪

  • 谱系追踪小鼠建立：将CK19-CreERT和Rosa26-mTomato两种基因修饰小鼠杂交，获得能特异性且可诱导追踪CK19+ 细胞的动物。
  • 诱导标记：在实验开始前7天和6天连续两天口服给予每只小鼠6mg他莫昔芬（tamoxifen），诱导Cre重组酶进入细胞核，永久性激活并表达mTomato荧光蛋白。
  • β细胞消融模型：通过连续5天腹腔注射50mg/kg的去氧链脲佐菌素（streptozotocin, STZ）实现β细胞消融，最终筛选出非空腹血糖>12mmol/L小鼠作为实验对象。

3. 胰腺内CDM注射及动物监测

  • CDM注射分组：在STZ诱导型高血糖模型小鼠中，于第10天（短期，21天监测）或第14天（长期，42天监测），分别用Wnt+ CDM、对照CDM或普通培养基直接注射胰腺（20μl，蛋白含量2-5μg）。
  • 生理参数监控：每周两次测量非空腹血糖及体重，于第42天做葡萄糖耐量试验（静脉注葡萄糖后定时取血监测血糖）。
  • 细胞增殖检测：部分小鼠于CDM注射后，连续3天腹腔注射5-ethynyl-2’-deoxyuridine (EdU)，用于标记增殖细胞。

4. 组织病理及免疫组化

  • 切片制备与染色：胰腺组织冷冻切片，做胰岛素、胰高血糖素（glucagon）、CK19、腺泡细胞标志物MPX1等多重免疫荧光染色。
  • β细胞质量定量：计算胰岛素阳性细胞面积/胰腺总面积×胰腺质量，统计胰岛数量与β细胞/α细胞比。
  • 谱系转分化定量：统计胰岛内tdTomato+/胰岛素+双阳性细胞比例，从而判定CK19来源细胞向β细胞的分化贡献。
  • 流式细胞分析：消化胰腺组织成单细胞悬液，利用流式细胞仪分析CK19、INSULIN、tdTomato三重标记的细胞群体，实现更高尺度量化。

5. 统计学分析

  • 数据处理：利用GraphPad Prism 9，采用双因素方差分析、单因素方差分析加Tukey多重比较，显著性标准*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001。

主要实验结果

1. MSC分泌物及Wnt+ CDM成分分析

  • CHIR99021刺激MSC可显著上调β-catenin入核，证明Wnt通路被强效激活。
  • 无论Wnt+还是对照CDM，提取后MSC细胞表型和活性均维持良好。

2. CK19+细胞谱系追踪效率及特异性

  • 他莫昔芬剂量优化后，最高可使8%全胰腺细胞和21.7% CK19+细胞被成功tdTomato标记。
  • 部分腺泡细胞（约17% MPX1+细胞）也会被低水平标记，2.2%的胰岛素+细胞基线时有tdTomato阳性，提示标记有一定“渗漏”。
  • 但CK19蛋白表达主要还是局限于胰腺导管上皮，为谱系追踪奠定基础。

3. CDM促进胰岛再生和β细胞恢复

  • 21天短期分析：Wnt+ CDM和对照CDM注射组小鼠，血糖下降趋势明显，β细胞质量恢复显著优于普通培养基组（Wnt+ 0.45mg vs对照0.39mg vs培基0.19mg）。
  • 42天长期分析：Wnt+ CDM组血糖控制优于普通培养基组，葡萄糖耐量改善显著。女性小鼠在Wnt+ CDM刺激下，β细胞质量提升更加明显。
  • 流式分析：21天时，Wnt+组胰岛素+/tdTomato+双阳性细胞占比由1%提升至5%，对照CDM组也达4.3%，普通培养基组依然为1%。

4. CK19+谱系贡献于β细胞再生

  • 经过Wnt+ CDM注射，11天时少量CK19+谱系追踪细胞获得胰岛素表达并进入胰岛，主要集中在较大成熟胰岛结构内，小型新生胰岛中呈低表达。
  • 同时，CK19+细胞的转分化现象在对照CDM组也有发生，显示MSC分泌因子而非Wnt激活本身对胰岛再生具有核心作用。
  • 到第42天，胰岛中CK19+/INSULIN+双阳性细胞比例有所下降，提示后期其贡献减小，可能有其他细胞类型主导再生。

5. 胰导管-胰岛直接关联性及β细胞增殖机制

  • 胰岛与导管直接接触的频率在各组无统计学差异，但Wnt+ CDM及CDM组在42天时，胰岛内CK19+细胞比例较高。
  • EDU标记新生β细胞增殖率：三组均约1%，对照组和CDM组之间无显著差异。提示β细胞再生并不是单纯由现存β细胞自我增殖主导。

结论与价值

本研究首次利用高效的谱系追踪系统，综合充分的动物实验与细胞、分子生物学检测手段，证实了CK19+导管/腺泡来源细胞可在MSC分泌因子刺激下部分转分化为胰岛素分泌β细胞，直接参与受损小鼠胰腺胰岛再生。MSC分泌物中，Wnt信号激活后以高效、低免疫原性、无需直接移植MSC细胞本身的新型生物制剂的形式，表现出显著的组织再生和糖代谢改善效果。

研究还证明了，即使CK19+谱系贡献明确，仅约5%新β细胞来自其转分化，意味着胰岛再生还存在其他重要细胞来源路径，有待今后Alpha到Beta，腺泡向β转分化谱系等更深入的追踪研究予以解答。此外，MSC分泌物配方优化与再生蛋白精确定性，为未来开发糖尿病“无细胞”再生药物奠定了理论与实验基础。

亮点与创新

  1. 首次定量证实CK19+谱系贡献于β细胞再生：为导管/腺泡细胞分化成为功能性β细胞提供直接动物实验证据。
  2. MSC分泌物诱导型再生模式：提出了“分泌物生物药替代活细胞移植”的可行路径，减小了临床转化的安全和监管障碍。
  3. 谱系追踪技术创新应用：采用CK19-CreERT×Rosa26-mTomato双转基因模型，结合流式分选，高精度跟踪新生成β细胞谱系来源。
  4. Wnt信号优化MSC再生能力：展示了调控Wnt pathway显著提升MSC分泌物的再生蛋白产能，为个体化细胞产品标准化提供新思路。
  5. 实验动物模型“转型”：不仅在免疫缺陷动物，也在免疫完整小鼠中验证了MSC分泌因子的再生作用，增强成果的临床相关性。

其它有价值信息

  • 研究设计科学，样本量充分，数据以均值±标准差方式报告，统计学方法规范，为结果的可靠性提供有力支持。
  • 结果提示不同性别小鼠对CDM再生效应存在差异，为未来个体化医学提供思路。
  • 研究团队已着手进一步探索MSC分泌物在自身免疫型糖尿病模型（如NOD小鼠）中的免疫调节作用，并追踪更多潜在转分化谱系，为β细胞再生的多元来源理论提供新证据。

研究的意义与影响

本研究从细胞和分子基础层面深化了对胰岛β细胞再生机制的理解，不仅推动了再生医学和分子糖尿病治疗的科学发展，也为临床开发安全、有效、来源明确的胰岛再生新药物—如MSC分泌物制剂—提供了坚实理论依据。针对当前1型糖尿病无法治愈的困境，研究打破“β细胞再生仅来源于自我增殖”传统观念，为未来通过调控内源性前体细胞、多细胞谱系协同再生以实现功能性胰岛重建提供了新方向。整体而言，研究为1型糖尿病治愈带来新希望，同时丰富了组织再生与细胞分化领域的理论体系，具有重要的科学与实际应用价值。