运动训练小鼠骨髓间充质干细胞来源外泌体通过抑制巨噬细胞M1极化促进创伤愈合

2025-06-24 Tue
一、学术背景及研究意义创面愈合是一个高度复杂的生理过程，在组织再生、修复以及免疫调控中扮演着至关重要的角色。然而，慢性伤口愈合不良在临床上广泛存在，不仅严重影响患者的生活质量，更加重了医疗与社会经济负担。其中炎症反应作为创伤愈合的第一阶段，对于后续愈合过程的质量起着决定性作用。过度或持续的炎症反应可导致愈合延迟和瘢痕增生。巨噬细胞（macrophage）作为免疫微环境的重要调节者，在炎症调控、组织修复及疤痕形成等方面发挥核心作用。其中，M1 型巨噬细胞偏向促炎反应，其过度活化会加重炎症并阻碍正常修复，因此有效调控巨噬细胞极化状态成为改善慢性创面愈合的一大关键科学难题。
近年来，间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells, MSCs）因具备自我更新、多向分化潜能，及其卓越的免疫调控、组织修复能力，成为再生医学及炎症调控研究的热点。然而，越来越多证据表明MSCs的旁分泌效应（paracrine effect），尤其是通过分泌外泌体（exosome），在促进组织再生和免疫调控中起着主导作用。外泌体不仅可显著降低细胞治疗的免疫排斥反应和移植相关风险，更因其携带丰富的蛋白质、脂质及非编码RNA等生物活性成分，被认为是细胞外信号传导和细胞—细胞通讯的重要媒介。已有研究发现，MSCs衍生外泌体能够调控巨噬细胞向抗炎的M2型极化，促进创面愈合，但利用MSCs外泌体抑制M1极化的机制及应用仍需深入挖掘。
另一方面，适量运动（exercise）早已被证实对系统免疫、代谢和组织修复具有积极促进作用，并能调节MSC的数量及功能，提升其增殖和迁移能力。部分研究表明，通过药物或生理刺激预处理的MSCs可增强旁分泌及治疗活性，但运动干预对MSCs及其外泌体的分泌功能、免疫调控及促进组织修复的影响尚未有系统性原始数据。
本研究因此聚焦于：适度有氧运动能否从源头上增强骨髓间充质干细胞（Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells, BMSCs）的外泌体分泌及功能，进而通过抑制巨噬细胞M1极化，有效缓解炎症反应并加速创面愈合。这一科学问题不仅丰富了运动-干细胞-免疫调控串联机制理论，也为开发新型无细胞组织修复治疗策略提供了前沿实验基础与理论依据。
二、论文来源与作者介绍本项研究题为“Exosomes derived from bone marrow-derived mesenchymal stem cells of exercise-trained mice improve wound healing by inhibiting macrophage M1 polarization”，第一作者为Jiling Qiu，其他作者Yifan Zhao、Yingyi Chen、Yanxue Wang、Juan Du、Junji Xu、Lijia Guo和通讯作者Yi Liu。作者均来自中国首都医科大学附属北京口腔医院，北京市牙齿再生与功能重建重点实验室、组织再生与免疫学实验室以及口腔正畸科。该论文发表于2025年，由Oxford University Press出版的权威学术期刊。
三、研究流程详解1. 实验设计与研究对象本研究围绕“骨髓间充质干细胞外泌体、运动干预、巨噬细胞极化、炎症及创面愈合”等主题，采用了系统的体内外实验，并以小鼠模型为主要对象。研究流程体系包含动物运动干预、BMSCs的分离培养、外泌体提取及功能鉴定、体外巨噬细胞功能实验、分子机制分析、皮肤创面体内模型及细胞消融、组织病理及分子生物学检测等多个层级。
主要实验步骤：
（1）运动小鼠模型的建立对象：12只C57BL/6J SPF级雄性小鼠，6周龄，约20g。
分组：随机分为对照组5只（静止饲养），运动组5只（跑台运动），独立通风饲养，自由饮食饮水。
运动方案：运动组小鼠进行连续6周的逐步递增强度跑台锻炼：前2周以7米/分钟，后4周为9米/分钟，每天30分钟/次。
（2）BMSCs的分离与培养动物安乐死后，取股骨与胫骨骨髓液，PBS稀释离心收集骨髓细胞。
α-MEM培养基初代接种，细胞达到80%融合后传代，取第3代供实验。
检测增殖（CCK-8法）及凋亡（Annexin V-FITC流式细胞仪）。
（3）外泌体的提取及鉴定条件培养基诱导BMSCs分泌外泌体，采用超高速离心法分级提取。
纯化后外泌体进行透射电镜（TEM）形态观测、粒径及分布（多角度粒径分析仪），Western blot鉴定特异性蛋白：CD9、CD81为正指标，Calnexin为阴性对照。
（4）体外巨噬细胞提取及M1极化模型10周龄雄性C57BL/6J小鼠腹腔注射4%硫代葡萄糖酸钠溶液诱导巨噬细胞招募，3天后采集腹腔灌洗液离心收集细胞。
M1极化诱导：四组比较，分别为正常对照、LPS（500 ng/ml）处理组、LPS+对照外泌体组、LPS+运动外泌体组，各处理24小时。
（5）外泌体摄取检测外泌体标记荧光探针（Cy5-E SE），与巨噬细胞共孵育6小时，经共聚焦显微镜证实细胞摄取。
（6）炎症及极化相关分子检测qpcr检测巨噬细胞内TNF-α、IL-6、IL-1β等炎症因子表达。
流式细胞术分析M1（CD86+）群体比例。
Western blot检测信号通路蛋白p65、p-p65、p38、p-p38表达及磷酸化状态。
（7）小鼠皮肤全层创伤修复模型38只8周龄雄性小鼠，背部制备直径10mm全层环形切口，分为对照组、PBS组、对照外泌体组（300μg）、运动外泌体组（300μg），各组局部注射。
部分小鼠采用Clophosome-A脂质体静脉消融巨噬细胞，探讨巨噬细胞在修复过程中的作用。
（8）组织病理与分子检测H&E和Masson染色观察炎症细胞浸润及胶原合成。
免疫组化（IHC）检测炎症因子（TNF-α、IL-6、IL-1β）。
免疫荧光（IF）双染检测巨噬细胞（F4/80+）及M1型（iNOS+）分布。
2. 数据分析方法采用GraphPad Prism 9.4数据统计软件。
数据以均数±标准差表示，采用单因素方差分析（One-way ANOVA）进行多组间比较，差异显著性 p≤0.05。
四、主要研究结果与逻辑1. 运动增强BMSCs增殖与外泌体分泌运动组BMSCs增殖能力显著增强，细胞凋亡差异不显著；
TEM显示运动组与对照组外泌体均为囊泡状，直径约110 nm，粒径分布一致（60~160 nm），无明显结构差异；
Western blot：运动组与对照组外泌体均高表达CD9和CD81，未检出Calnexin，纯度可控；
蛋白定量及DLS检测证实运动显著提升每单位细胞外泌体产量。
2. 运动外泌体抑制巨噬细胞M1极化（体外）Confocal显微成像确认外泌体能被巨噬细胞摄取；
qpcr和流式检测：运动组外泌体处理的巨噬细胞，促炎因子（TNF-α、IL-6、IL-1β）表达水平、M1标志性CD86阳性率显著低于对照组；
Western blot：LPS诱导组p65/p38磷酸化水平升高，对照外泌体可下调该途径，运动外泌体下调更为显著，提示其通过阻断p65/p38活化有效抑制M1极化。
3. 运动外泌体促进创面愈合（体内）创伤后1、3、6、9天拍照分析创面面积变化，运动外泌体组愈合速度最快且优于对照；
H&E及Masson染色表明，运动外泌体组创面炎症细胞浸润减少，真皮组织层恢复更规则、胶原纤维更致密粗厚。
4. 运动外泌体促进愈合依赖巨噬细胞巨噬细胞消融（F4/80阴性）组，运动外泌体无法进一步促进创面愈合，提示其机制依赖巨噬细胞的存在及功能调控。
5. 运动外泌体抑制炎症与M1极化（体内）IHC检测（创伤第4天）：运动外泌体组创面边缘组织内TNF-α、IL-6、IL-1β表达量均显著低于对照外泌体组；
IF检测：运动外泌体组F4/80+iNOS+（M1型）双阳性巨噬细胞数目最低，炎症微环境改善最显著。
五、结论、学术与应用价值本研究系统揭示了适量运动干预能够显著提升BMSCs外泌体分泌水平，并增强其免疫调控活性。运动外泌体作为一种高效无细胞治疗策略，能够通过抑制巨噬细胞M1型极化，降低炎症因子水平，显著改善组织炎症微环境，加速全层皮肤创面的愈合。其作用机制主要包括阻断p65/p38信号通路，抑制炎症级联反应。进一步经巨噬细胞消融实验佐证了该效应依赖巨噬细胞存在，为理解运动-干细胞-免疫-修复调控网络机制提供了创新证据。
六、研究亮点与创新性多学科交叉创新：本研究紧密结合运动生理学、干细胞生物学、免疫学、再生医学等多个领域，首次系统性提出运动可重塑MSC外泌体的功能。
机制层级丰富：不仅揭示了运动对MSC及其外泌体产量的影响，更深入探究其调控巨噬细胞极化、分子信号转导、创伤修复的多级作用机制。
技术路线精细严谨：利用动物跑台运动、外泌体超高速离心提取、流式/共聚焦/病理三位一体检测，多角度、分层次验证了研究假设。
首次提出外泌体介导运动免疫调控：为运动促进健康、再生医学转化治疗衍生新方向铺路。
高度可转化的应用前景：运动外泌体可做为新型无细胞组织修复材料，有望突破细胞移植的伦理与安全障碍，推动精准免疫调控与组织修复结合。
七、其他重要信息资金支持：本项目获北京市医院管理局临床医学发展专项、国家自然科学基金、首都医科大学附属北京口腔医院创新团队等资助。
利益冲突：作者声明无潜在利益冲突。
数据获取：相关原始数据可通过通讯作者合理申请获得。
八、研究局限与展望尽管本研究揭示了运动外泌体对巨噬细胞极化及创面修复效应的机制，但对于其具体外泌体载荷、生物活性物质谱以及与其他免疫细胞的串联调控机制仍待后续深入剖析。此外，未来需进一步评估其在大动物乃至临床人群中的安全性及疗效，为其转化应用提供更坚实的科学依据。
九、综合评价Jiling Qiu等研究团队利用一系列科学严谨的动物模型及分子生物学技术，首次将运动与干细胞外泌体及免疫调控三者串联，拓宽了创面修复领域研究的新视角。结论不仅为基础科学研究提供新机制，更在外泌体无细胞疗法的应用领域展现了光明前景。整体研究内容扎实、流程严谨、数据支撑充分、创新性突出，对加速创面愈合、慢性炎症干预及无细胞再生治疗具有重要的理论与实践意义。