神经干细胞来源的细胞外囊泡缓解小鼠特应性皮炎模型中的炎症反应

一、学术背景及研究动因

特应性皮炎(Atopic Dermatitis, AD)是一种常见的慢性炎症性皮肤疾病,以湿疹样皮损、剧烈瘙痒及皮肤屏障功能障碍为主要特征。其发病机制极为复杂,涵盖了遗传易感性、表皮屏障损伤、免疫调节失衡及环境因素等多重作用。已有研究证实,特应性皮炎不仅影响患者皮肤健康,还高度影响生活质量,并与呼吸道过敏、变态反应及部分自身免疫疾病(如类风湿关节炎、炎症性肠病)等共病密切相关。

目前,特应性皮炎主要治疗手段包括糖皮质激素及免疫抑制剂,但相关治疗多只能带来暂时缓解,且长期应用存在诸多副作用(如皮肤萎缩、色素改变、系统性不良反应等),使得临床患者的长期管理充满挑战。因此,寻找新的机制和干预路径成为当前领域热点。

干细胞及其衍生物近年来因其免疫调节与再生修复潜力而备受关注,尤其是间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cell, MSC)在动物实验和部分临床研究中显示出调节免疫、修复皮肤屏障的作用。胞外囊泡(Extracellular Vesicles, EVs)作为干细胞分泌的纳米颗粒,其携带蛋白质、mRNA、miRNA、脂质等多种活性因子,被认为是细胞与细胞间信息交流及调节炎症的“信使”。一些研究已证实MSC来源EVs能够缓解AD小鼠模型的皮肤炎症和修复表皮。然而,关于神经干细胞(Neural Stem Cell, NSC)来源的胞外囊泡在特应性皮炎中的作用机制和潜力尚未见系统性研究。

因此,本研究针对当前特应性皮炎治疗的难题与新型治疗策略的需求,首次系统性探究了神经干细胞及其来源胞外囊泡在调控AD炎症反应及皮肤修复中的作用机制,并通过蛋白质组学进一步解析其分子基础。

二、论文来源及作者信息

本文题为“neural stem cell-derived extracellular vesicles alleviate inflammatory responses in a mouse model of atopic dermatitis”,由Seulbee Lee, Donghun Hyun, Yong Namkung, Boram Park, Byounggwan Lee, Junhyung Myung, Sunghoi Hong等多位学者完成,通讯作者为Sunghoi Hong。作者均来自韩国高丽大学(Korea University)生命与健康科学相关院系,该校为韩国生物医学研究领域的著名学府。文章于2025年发表于Oxford University Press主办的学术期刊(详见原文DOI:10.1093/stmcls/sxaf034),为开放获取(Open Access),高度便于学术交流。

三、研究设计与技术流程详解

1. 整体研究设计与主要流程

本研究为原创实验研究,整个流程涵盖: - 神经干细胞与其条件培养基(Conditioned Media, CM)、胞外囊泡(EVs)的制备与分离 - 在体外炎症模型(人源角质细胞HaCaT、鼠源巨噬细胞RAW264.7)中检测其抗炎作用 - 在体内特应性皮炎小鼠模型中评价其临床疗效与病理改善 - 对NSC-EVs进行蛋白质组学鉴定,探讨其分子机制

1.1 干细胞及胞外囊泡的制备与分离

作者选用人源永生化神经干细胞(immortalized NSCs)为干细胞来源。细胞培养采用高糖型Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)+10%胎牛血清或去外泌体血清,常规条件培养。培养基在细胞至90%融合态时收集,离心去除细胞与大碎片,经0.22μm过滤后再通过100kDa分子量切断离心滤器浓缩,最终通过Exo-i专利纯化柱完成EVs分离(属于当前较为先进的纳米颗粒纯化技术,能显著提高外泌体纯度)。EVs浓度通过BCA蛋白定量法进行控制,保证实验的一致性。

1.2 胞外囊泡的表征

作者对分离所得胞外囊泡进行结构与表面标志表征。利用场发射透射电子显微镜(FE-TEM)观察形态特征,结合动态光散射(DLS)、纳米颗粒跟踪分析(NTA)评估颗粒大小分布。蛋白层面,采用免疫印迹(Western Blot)检测EVs经典表面标志CD63、CD9,确保纳米囊泡纯度符合国际Misev2018标准。胞外囊泡细胞内摄实验采用PKH67荧光标记,借助激光共聚焦显微镜实时观察颗粒被角质细胞摄入后的定位。

1.3 体外炎症模型实验

  • HaCaT角质细胞炎症模型:使用TNF-α、IFN-γ诱导炎症。分别以不同浓度的NSC-CM(10%、50%、100%)和不同剂量NSC-EVs(50μg、100μg、500μg)处理。通过RT-PCR检测炎症相关细胞因子(如IL-6、TNF-α)、趋化因子(如RANTES、MCP-1、TARC)mRNA表达;Western Blot分析NF-κB(总蛋白、磷酸化状态)与IL-1β表达。
  • RAW264.7巨噬细胞炎症模型:用LPS刺激诱导炎症,同步加用NSC-CM。分析与上述类似,包括炎症因子、趋化因子、炎症酶(iNOS、COX-2)表达,以及NO(Griess试剂比色法)释放。

1.4 体内特应性皮炎小鼠模型

  • 实验动物采用8周龄NC/Nga雄性小鼠,随机分五组:阴性对照、AD模型、NSC-CM治疗组、NSC-EV治疗组、他克莫司阳性对照组。采用2,4-二硝基氯苯(DNCB)诱导小鼠背部皮肤出现AD样皮损。
  • 治疗分组分别每日外用PBS、NSC-CM、NSC-EVs或他克莫司三周。通过肉眼评分、拍照、HE及甲苯胺蓝染色的组织病理观察(包括表皮厚度及肥大细胞浸润定量),评价疗效。
  • PKH67标记NSC-EVs皮肤吸收实验,用于证明其纳米囊泡可穿透皮肤屏障。

1.5 蛋白质组学分析

  • NSC-EVs经裂解、FASP法酶解、TMT标记后,经反相液相色谱分离、C18柱脱盐,最后通过高灵敏度LC-MS/MS进行蛋白质鉴定。
  • 数据分析采用Proteome Discoverer软件,所有结果FDR控制在1%以内,仅计入至少有2个特异性肽段的蛋白。聚焦前100个丰度最高蛋白,利用STRING(蛋白互作数据库)、R语言circlize包进行蛋白互作及功能富集分析。Gene Ontology(GO)富集分析由ShinyGO平台完成,聚焦生物过程与细胞成分。

2. 主要实验结果与数据详解

2.1 NSC-CM与ADSC-CM免疫反应比较

抗体阵列分析显示,与脂肪来源间充质干细胞条件培养基(ADSC-CM)相比,NSC-CM中炎症因子水平(如IL-6、RANTES、MCP家族等)显著更低,提示其具有更强的免疫“耐受性”。

2.2 体外炎症模型获益

  • HaCaT实验:100% NSC-CM可显著下调IL-6、TNF-α、TARC、RANTES、MCP-1等关键炎症因子的表达。免疫印迹实验发现,NSC-CM剂量依赖性抑制NF-κB磷酸化及IL-1β蛋白表达,但不影响NF-κB总蛋白。这提示其通过NF-κB通路负向调控炎症。
  • RAW264.7实验:NSC-CM可有效抑制LPS诱导的巨噬细胞活化,表现为细胞形态恢复静息状态,炎症因子和炎症酶表达显著下调,NO释放减少。抑制效果同样呈剂量依赖,其中100% NSC-CM最为显著。

2.3 NSC-EVs的纯度及功能鉴定

EVs经电子显微镜、DLS和NTA表征,主峰分布于50-200nm,形态典型“杯状”,CD63与CD9蛋白高度表达。PKH67标记后证实其可被角质细胞有效摄入。

炎症实验中,不同剂量NSC-EVs可显著抑制RAW264.7巨噬细胞的炎症激活及炎症标志物(如IL-6、TNF-α、IL-1β、RANTES、MCP-1、iNOS、COX-2)表达,并降低NF-κB磷酸化水平,显示出极强的免疫抑制效应。

2.4 体内AD小鼠模型疗效

NSC-CM与NSC-EVs外用可显著降低小鼠AD样皮损严重度,改善表皮增厚和结痂,皮肤毛发恢复,疗效与他克莫司相当。特别是组织病理学显示,NSC-EVs组肥大细胞浸润减少近50%,HE染色表皮厚度显著减薄。用PKH67标记证实NSC-EVs可渗透至表皮、真皮,以毛囊周围分布为主。这为其实际外用应用提供了理论基础和实验依据。

2.5 蛋白质组学解析

LC-MS/MS共鉴定出2650种蛋白,以丰度前100个为主进行深入分析。互作网络、GO富集显示,部分蛋白(如S100A8、SERPINA1、A2M等)与免疫调节和抗炎密切相关,部分蛋白(如FN1、COL1A1、HSPG2、ITGB1等)主导皮肤再生、创伤修复和ECM重塑。此外,血浆蛋白、补体成分(C3)等富集,提示NSC-EVs具备双重功能:既能缓解过度炎症,还能促进皮肤组织再生修复。

四、结论与意义

本研究全方位展示了神经干细胞来源胞外囊泡及其条件培养基对特应性皮炎的潜在治疗价值。其主要结论为:

  • NSC-CM与NSC-EVs均可有效下调体外模型中的炎症因子,抑制NF-κB信号,减少巨噬细胞激活,具有显著免疫抑制作用。
  • AD小鼠外用NSC-EVs可有效改善皮肤症状,抑制肥大细胞炎症浸润,促进表皮屏障修复,疗效可与临床一线药物相媲美。
  • NSC-EVs内富集大量与免疫调节和组织再生相关的活性蛋白质,通过蛋白质组学建立其作用分子基础,为机制研究与未来开发提供有力支撑。

科学意义上,本研究首创性提出神经干细胞胞外囊泡在特应性皮炎抗炎及屏障修复中的双重功能,提供了全新的细胞外基“无细胞疗法”思路。其对理解皮肤炎症治疗新策略和干细胞来源外泌体作用具有重要参考价值。

实际应用层面,NSC-EVs作为一种“无需活细胞接种”的纳米药物形式,具有更高纯度、更低免疫原性和更易于配制外用制剂等优势,为未来特应性皮炎、复杂慢性皮肤炎症、甚至更广泛再生医学提供了可拓展的新思路。

五、研究亮点与创新

  • 研究对象创新:首次系统性研究神经干细胞外泌体在特应性皮炎的作用机制,弥补了以往以间充质干细胞为主的研究空白。
  • 技术路线突出:外泌体分离强调高纯度专利Exo-i柱、蛋白组学调动TMT标记LC-MS/MS和R语言交互分析,方法科学严谨现代。
  • 靶点明确且机制联动:同时追踪NF-κB信号、炎症因子、组织细胞学、蛋白组多维证据整合,链条清晰。
  • 应用前景广阔:外泌体外用制剂潜力明确,具备良好临床转化前景,且为纳米药物学拓展新场景提供样本。

六、其他补充信息

为保障数据质量,研究明确了统计分析方法(包括多组方差分析及恰当多重校正),所有数据或代码可向通讯作者请求获取。作者声明无潜在利益冲突,获得相关伦理审批,保证了研究的科学性和合规性。

同时文献综述补充了各路干细胞和外泌体在AD等多种疾病中的进展与不足,对比分析下凸显本研究的差异与优势。

七、展望与启示

随着皮肤慢性炎症与过敏性疾病患病率上升,有效且安全的新型无细胞治疗方式势必成为热点。NSC-EVs及其蛋白系统的深入研究,将为靶向免疫调节和组织再生开启全新窗口。未来可重点聚焦其规模化制备、储存和跨膜递送(如微针、纳米载体水凝胶等),并结合更广泛的转录组、功能实验,推动向临床应用转化。

此项研究立足问题前沿,开拓性方法和多维结合为国际皮肤病与再生医学研究及产业化拓展提供了重要参考。