一种特异性带负电荷序列赋予Munc13-1蛋白突触胞吐功能的分子内调控

2025-06-23 Mon
解锁神经递质释放调控新机制：Munc13-1新型自抑制结构及其钙调节作用研究综述一、学术背景与研究缘起神经元间信号传递依托于化学突触，突触前神经末梢的神经递质通过囊泡外排（突触胞吐，synaptic exocytosis）精准释放，而突触活动区（active zone，AZ）则为这一过程的分子基础平台。突触活动区的蛋白复合体不仅决定囊泡的对接、起始、融合以及递质释放的准确性，也在神经可塑性等高级神经功能中扮演核心角色。
在众多调控突触外排的分子中，Munc13家族蛋白（Munc13s）被认为几乎参与了外排全程的多步调控，承担了囊泡对接、预融合（priming）以及最终融合等多项关键任务。特别是在哺乳动物脑组织中，Munc13-1作为主要表达的亚型，不仅维持突触传递的基本功能，还调控如短时程突触可塑性等重要生理过程。不过，虽然Munc13-1的C端保存区（包括C2和MUN结构域）已被详尽研究，该蛋白独特的N端低复杂度区域（low-complexity region）的具体功能与调控机制尚未完全阐明，尤其是这一区域如何通过分子内（intramolecular）作用影响Munc13-1活性的分子细节和生理意义尚属未知。
上述科研背景下，研究者希望解答：Munc13-1特有的N端低复杂度区域是否包含功能性结构模块？这一模块如何影响蛋白的自抑制和激活？钙离子（Ca²⁺）或蛋白磷酸化等调控是否参与这一过程？这些问题的回答不仅丰富我们对基础神经生物学的认识，还有望为神经系统疾病的机制研究和干预手段开发提供理论基础。
二、论文来源与作者信息本项原始研究论文题为“A specific negatively charged sequence confers intramolecular regulation on Munc13-1 function in synaptic exocytosis”，由Kexu Zhao、Li Zhang、Mengshi Lei、Ziqi Jin、Tianxin Du等人完成，通讯作者为Shen Wang与Cong Ma，主要研究单位包括华中科技大学生命科学与技术学院分子生物物理教育部重点实验室、人工智能与自动化学院、广州医科大学第二附属医院神经遗传学与离子通道病教育部重点实验室等。该论文发表于2025年6月9日的《Proceedings of the National Academy of Sciences》（PNAS），为PNAS直接投稿并经邀请特约编辑审核。
三、研究流程的细致梳理本研究立足分子和细胞水平，结合生物信息学、结构预测、生化实验、光学技术和神经电生理等多手段，全面解析了Munc13-1 N端低复杂度区内负电性序列（polyE）的物理属性、进化保守性、与MUN结构域的分子内自抑制作用，以及钙调节和磷酸化对其活性的调节机制。
1. 研究对象与样本来源蛋白质材料：以人源及动物源Munc13家族亚型表达蛋白为主，进行体外重组纯化和功能研究。
细胞/动物模型：以小鼠初级皮层神经元为体外电生理和基因敲降-拯救实验对象。
序列进化比对：涵盖从线虫到人类的多物种基因。
2. 生物信息学与序列保守性分析a. polyE序列的发现研究团队对比不同Munc13亚型N端低复杂度序列，发现Munc13-1在317-370位点处含有富含谷氨酸（glutamate, Glu）和天冬氨酸（aspartate, Asp）的负电性残基簇，显著高于其他亚型。通过自研的Glu&Asp cluster score（已在GitHub公开）量化分析，polyE区域显示出极为突出的酸性残基聚集性，并确认该序列于鸟类及高等恒温动物中保守存在，提示其进化上的功能重要性。
b. 结构学和功能注释借助AlphaFold-Multimer结构预测，科研团队识别出polyE为一段可转变为α-螺旋的酸性簇，其与MUN结构域D亚域中具正电的K1494、K1495、K1500等赖氨酸紧密接触，暗示可能形成盐桥，促进分子内自抑制。
3. 生化与结构功能实验a. 蛋白互作实验利用GST pull-down、荧光各向异性、微量热泳动（MST）等技术，研究团队系统评价了polyE与MUN结构域的结合情况。结果表明，polyE结合MUN的结合常数（Kd）为24.19 μM，其结合依赖电荷互作，盐浓度升高（如1M NaCl）可完全抑制结合，突变K1494E/K1495E/K1500E亦可废除结合。
b. 分子自抑制模型验证通过设计polyE与MUN利用23GS人工连接子连接的嵌合蛋白（Elm），并与自由polyE/MUN结合活性对照，进一步证实polyE可折回结合MUN D亚域，形成类自闭合构象，阻碍其与下游底物结合。同时，用圆二色谱（CD）光谱分析也发现，polyE在游离状态多为无构象，但结合MUN后呈α-螺旋，局部结构发生明显改变，证实其构象可塑性。
c. SNARE复合物组装功能测试基于FRET（共振能量转移）体系，团队构建了Munc18-1/Syntaxin-1/Synaptobrevin/SNAP-25组成的经典SNARE复合物组装体外反应体系。结果表明，Elm（polyE-MUN嵌合物）不仅在生理离子强度下显著降低SNARE复合物组装活性，在低离子强度下自抑效果更为明显。上述突变体/嵌合体可解除抑制，恢复活性。
4. 功能调控机制探索a. 关键调控位点的突变与磷酸化效应通过对MUN D亚域S/T位点设计磷酸化模拟突变（T1496E、S1501E等）， pull-down及FRET实验发现这些突变减弱了polyE与MUN的结合，解除抑制并提升SNARE组装效率。蛋白表达与电生理实验也证实，表达polyE缺失体或MUN关键位点突变体的神经元，其迷你兴奋性突触后电流频率（mEPSC）、诱发性EPSC振幅、可释池（RRP）容量均显著升高，表明自抑制作用被解除。
b. 钙离子调控研究借助等温滴定量热（ITC）技术团队发现polyE与Ca²⁺的结合常数约12.5 μM，对应于神经元单次动作电位诱导下终末局部[Ca²⁺]水平。进一步，利用单分子FRET（smFRET）追踪Syntaxin-1构象变化和SNARE复合物组装，通过加入40 μM CaCl₂，可显著解除Elm自抑状态，增强其下游活性，证实Ca²⁺是polyE调控的重要生理激活因子。
5. 神经元水平功能验证在小鼠皮层神经元中应用敲降-拯救策略，应用表达polyE缺失/关键位点突变/磷酸化模拟等Munc13-1变体，系统记录mEPSC、evoked EPSC及超常糖诱导释放数据，发现自抑解除体均显著提升释放概率，证实其对突触功能的调控作用。与之相比，野生型及去磷酸化拟态体（T1496A）与对照无明显差异，指出该调控机制对生理功能的精细调节意义。
四、主要研究发现与结论本项研究系统揭示了Munc13-1 N端低复杂度区域的polyE负电性簇为蛋白特有自抑制模块，能通过分子内电荷互作稳定“闭合”抑制状态。高频神经活动产生的Ca²⁺流的局部短暂升高可通过直接结合polyE，高效打断自抑结合，激活Munc13-1以促发SNARE组装和神经递质释放。与此同时，蛋白特定位点的可逆磷酸化（如T1496）为自抑构象提供了更长时间尺度的调控。进化分析显示polyE为高等恒温动物Munc13-1所独有，其引入赋予该蛋白更高层次的神经可塑性调节功能。
五、科学意义与应用前景科学价值
揭示了Munc13-1蛋白调控神经递质释放的新型分子机制，赋予低复杂度区以明确、具体的自抑调控功能。
发现polyE序列为一种非常规的钙感受器（calcium sensor），扩展了Ca²⁺参与神经传递调控的分子图谱。
应用前景
该自抑/解除机制为突触短时程可塑性、神经活动依赖调节、信息编码等提供生物学基石，提示药物干预polyE-MUN互作可做为部分神经精神疾病、癫痫等靶向策略。
为开发新型蛋白调控分子、精细调节突触释放概率提供分子靶点。
研究亮点
明确挖掘并验证了Munc13-1 N端低复杂度区的功能，这是对长期困扰领域的疑问的系统解答。
综合运用蛋白质工程、结构预测、自制算法（Glu&Asp聚集判分）、高精度生物物理技术、钙调节等手段，实现了从序列、结构到神经元功能的全链条深入剖析。
指明polyE结构为进化新增，可作为高等功能脑区与复杂行为的分子基础之一。
六、研究中的其他有价值内容本研究开发的Glu&Asp cluster score算法公开于GitHub（https://github.com/shenwang3333/edclusterscore），为未来低复杂度序列与功能关联研究提供技术工具。
研究关注的磷酸化位点与多种突触前蛋白激酶相关，连接了第二信使、蛋白修饰与突触活动的关联网络。
七、总结展望本研究以多学科交叉视角，突破性揭示了Munc13-1蛋白新型分子内自抑—解除调控机制，为理解神经系统复杂信息处理和可塑性提供了关键分子和调控轴。未来该研究方向可向蛋白聚集调控、突触病态机制研究、药物筛选等领域拓展，具有极为广阔的基础和应用价值。