灵长类和人类视网膜中的高效碱基编辑

2025-03-08 Sat
高精度碱基编辑技术在灵长类和人类视网膜中的应用研究背景Stargardt病是一种目前无法治愈的遗传性神经退行性疾病，主要由于ABCA4基因的功能缺失突变导致黄斑变性和失明。ABCA4基因编码的蛋白是一种膜脂翻转酶，位于光感受器和视网膜色素上皮细胞（RPE细胞）中，负责防止有毒视黄醛在视网膜中的积累。Stargardt病最常见的突变是ABCA4基因中的c.5882G>A（p.Gly1961Glu）点突变，该突变导致蛋白质功能丧失，从而引发疾病。
尽管已有一些关于碱基编辑在细胞系和小鼠模型中的研究，但在人类和非人灵长类（NHPs）的神经组织中实现高效基因编辑仍是一个挑战。本研究旨在开发一种基于腺相关病毒（AAV）的腺嘌呤碱基编辑策略，以纠正ABCA4基因中的c.5882G>A突变，并在人类和非人灵长类模型中验证其高效性和精确性。
论文来源本论文由Alissa Muller、Jack Sullivan、Wibke Schwarzer等来自多个研究机构的科学家合作完成，主要作者来自Institute of Molecular and Clinical Ophthalmology Basel、Beam Therapeutics等机构。论文于2025年2月发表在《Nature Medicine》期刊上，标题为“High-efficiency base editing in the retina in primates and human tissues”。
研究流程与详细方法1. 碱基编辑策略的设计与优化研究团队首先设计了一种双AAV载体，编码一个分裂内含子腺嘌呤碱基编辑器（ABE），用于纠正ABCA4基因中的c.5882G>A突变。为了优化编辑效率，研究团队在人类模型（包括视网膜类器官、诱导多能干细胞（iPS细胞）衍生的RPE细胞、成人视网膜外植体和RPE/脉络膜外植体）中进行了ABCA4碱基编辑的优化。
2. 体外模型的碱基编辑验证研究团队在携带ABCA4 c.5882G>A突变的HEK293T细胞系中测试了不同的碱基编辑器和引导RNA（gRNA），并筛选出效率最高的gRNA。随后，研究团队在人类视网膜类器官、视网膜外植体和RPE/脉络膜外植体中验证了碱基编辑的效率。结果显示，在体外模型中，ABCA4基因的编辑效率达到了较高水平。
3. 小鼠模型的碱基编辑验证研究团队在小鼠模型中测试了AAV9-PHP.eB载体，并通过视网膜下注射将碱基编辑器递送至视网膜。结果显示，在小鼠视网膜和RPE/脉络膜组织中，ABCA4基因的编辑效率较高，且未检测到脱靶编辑。
4. 非人灵长类模型的碱基编辑验证研究团队在非人灵长类模型（NHP）中进一步验证了碱基编辑的效率。通过视网膜下注射，研究团队将AAV5-SABE1载体递送至NHP的视网膜，并评估了编辑效率。结果显示，在NHP的视网膜和RPE/脉络膜组织中，ABCA4基因的编辑效率达到了较高的水平，且在锥细胞和RPE细胞中表现出显著的编辑效果。
5. 碱基编辑器的优化与剂量效应研究团队进一步优化了AAV载体的包装效率，并测试了不同剂量的AAV5-SABE1载体在NHP中的编辑效率。结果显示，优化后的AAV5-V2-SABE1载体在较低剂量下仍能实现高效的基因编辑，且在锥细胞和RPE细胞中的编辑效率显著提高。
主要研究结果体外模型中的高效碱基编辑：在人类视网膜类器官、视网膜外植体和RPE/脉络膜外植体中，ABCA4基因的编辑效率达到了较高水平，且未检测到脱靶编辑。
小鼠模型中的高效碱基编辑：在小鼠视网膜和RPE/脉络膜组织中，ABCA4基因的编辑效率较高，且未检测到脱靶编辑。
非人灵长类模型中的高效碱基编辑：在NHP的视网膜和RPE/脉络膜组织中，ABCA4基因的编辑效率达到了较高的水平，且在锥细胞和RPE细胞中表现出显著的编辑效果。
碱基编辑器的优化与剂量效应：优化后的AAV5-V2-SABE1载体在较低剂量下仍能实现高效的基因编辑，且在锥细胞和RPE细胞中的编辑效率显著提高。
研究结论与意义本研究展示了在人类和非人灵长类视网膜中实现高效、精确的碱基编辑的可行性，为Stargardt病的基因治疗提供了新的策略。研究结果表明，基于AAV的腺嘌呤碱基编辑技术能够高效纠正ABCA4基因中的c.5882G>A突变，且在锥细胞和RPE细胞中表现出显著的编辑效果。此外，研究团队通过优化AAV载体的包装效率，进一步提高了碱基编辑的效率，并降低了所需的载体剂量。
研究亮点高效碱基编辑：本研究在人类和非人灵长类视网膜中实现了高效的碱基编辑，为Stargardt病的基因治疗提供了新的策略。
精确性：研究结果显示，碱基编辑在目标位点表现出高度的精确性，且未检测到脱靶编辑。
优化AAV载体：通过优化AAV载体的包装效率，研究团队进一步提高了碱基编辑的效率，并降低了所需的载体剂量。
非人灵长类模型验证：在非人灵长类模型中验证了碱基编辑的效率，为临床试验提供了重要的参考。
其他有价值的信息研究团队还通过全基因组筛查分析了碱基编辑的脱靶效应，结果显示在人类外植体中未检测到脱靶编辑，进一步证明了碱基编辑的精确性。此外，研究团队还评估了碱基编辑在视网膜外的其他组织中的编辑效率，结果显示编辑仅限于视网膜和RPE/脉络膜组织。
本研究的成功为其他可靶向碱基编辑的遗传性视网膜疾病的治疗提供了重要的参考，展示了碱基编辑技术在遗传性疾病治疗中的巨大潜力。