基于人工智能设计的全新荧光素酶实现多重生物发光成像

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基于人工智能设计的全新荧光素酶实现多重生物发光成像

学术背景

生物发光技术（bioluminescence）是一种高度敏感且非侵入性的成像技术，能够在活体生物中进行实时监测，而无需外部光源。荧光素酶（luciferase）是催化发光反应的关键酶，但天然荧光素酶存在诸多局限性，如蛋白质折叠不良、体积大、依赖ATP、催化效率低等。这些限制阻碍了生物发光技术在生物医学研究中的广泛应用。近年来，尽管通过定向进化（directed evolution）等方法对天然荧光素酶进行改造取得了一定进展，但仍无法完全克服这些局限性。

为了解决这些问题，研究团队利用基于深度学习的蛋白质设计方法，从头设计（de novo design）了一类新型荧光素酶，称为NeoLux系列。这些人工设计的荧光素酶不仅具有优异的催化效率、稳定性、体积小、不依赖ATP等特性，还能够与荧光蛋白（fluorescent protein, FP）结合，形成高效的荧光共振能量转移（FRET）系统，实现多重生物发光成像（multiplexed bioluminescence imaging）。这一研究为生物发光技术的应用开辟了新的前景。

论文来源

该研究由来自加州大学圣克鲁兹分校（University of California, Santa Cruz）的Julie Yi-Hsuan Chen、Qing Shi、Xue Peng等研究人员共同完成，通讯作者为Andy Hsien-Wei Yeh。论文于2025年3月13日发表在《Chem》期刊上，标题为“De Novo Luciferases Enable Multiplexed Bioluminescence Imaging”。

研究流程与结果

1. 第二代荧光素酶的计算机设计与实验验证

研究团队首先利用深度学习模型ProteinMPNN对第一代荧光素酶LuxSit-I的序列空间进行探索，设计了10,000个新的氨基酸序列。通过AlphaFold2预测这些序列的蛋白质结构，并筛选出191个候选序列进行实验验证。其中134个序列表现出荧光素酶活性，表明设计的序列能够保持原有的结构和功能。进一步筛选出20个活性最高的设计，进行大规模表达和纯化，最终获得了16个单体的荧光素酶。

为了进一步提高荧光素酶的活性，研究团队对NeoLux1的催化口袋进行突变组合筛选，获得了活性提高47%的NeoLux1.2。实验表明，NeoLux1.2具有极高的热稳定性（Tm > 100°C），并且对合成底物DTZ（diphenylterazine）具有高度特异性。此外，NeoLux1.2的信号衰减半衰期（decay half-life）长达43分钟，远高于天然荧光素酶，使其更适合高通量筛选（high-throughput screening）。

2. 荧光素酶-荧光蛋白FRET系统的设计

为了实现多重生物发光成像，研究团队将NeoLux1.2与多种荧光蛋白（如mNeonGreen、mGold、mKok、CyOFP1、mKate2）结合，设计了高效的FRET系统。通过AlphaFold2预测FRET对的结构，优化了荧光素酶与荧光蛋白之间的距离，从而提高了能量转移效率。实验验证了五种FRET对（LuxNeon、LuxGold、LuxKok、LuxOFP、LuxKate），它们的能量转移效率均超过90%，且保持了荧光蛋白的光谱特性。

3. 多重生物发光成像的应用

研究团队在细胞和活体小鼠中验证了这些FRET系统的多重成像能力。在细胞实验中，通过线性解混（linear unmixing）技术，成功区分了不同FRET对的信号，实现了对多个亚细胞结构的同步成像。在活体小鼠实验中，研究团队将表达不同FRET对的Hela细胞移植到小鼠体内，通过静脉注射DTZ底物，成功实现了多重生物发光成像。此外，研究团队还利用这些FRET系统，实时监测了肿瘤异质性（tumor heterogeneity）的动态变化，展示了其在癌症研究中的潜在应用价值。

研究结论与意义

该研究通过人工智能驱动的蛋白质设计方法，成功开发了一类新型荧光素酶NeoLux系列。这些荧光素酶不仅克服了天然荧光素酶的诸多局限性，还通过与荧光蛋白结合，实现了高效的多重生物发光成像。研究团队还展示了这些FRET系统在细胞和活体中的广泛应用，包括多重亚细胞结构成像、实时监测肿瘤异质性等。

这一研究为生物发光技术开辟了新的应用前景，特别是在癌症研究、药物筛选和生物医学成像等领域。此外，研究团队还提供了开放的设计序列和实验方案，显著降低了实验成本，促进了该技术在实验室中的广泛应用。

研究亮点

  1. 人工智能驱动的蛋白质设计：利用深度学习模型ProteinMPNN和AlphaFold2，从头设计了一类新型荧光素酶，展示了人工智能在蛋白质设计中的强大能力。
  2. 多重生物发光成像：通过设计高效的FRET系统，实现了在细胞和活体中的多重生物发光成像，为复杂生物过程的研究提供了新工具。
  3. 高稳定性和特异性：NeoLux系列荧光素酶具有极高的热稳定性和底物特异性，克服了天然荧光素酶的局限性。
  4. 低成本与广泛应用：研究团队提供了开放的设计序列和实验方案，显著降低了实验成本，促进了该技术在实验室中的广泛应用。

其他有价值的信息

研究团队还展示了这些FRET系统在实时监测肿瘤异质性中的应用，为癌症研究提供了新的工具。此外，研究团队还开发了低成本的多重生物发光成像技术，为生物医学研究提供了经济高效的解决方案。

该研究不仅推动了生物发光技术的发展，还为人工智能在蛋白质设计中的应用提供了新的范例，具有重要的科学意义和应用价值。