PDGFR标记骨膜内不同的间充质和周细胞群体及其重叠的细胞特征

2025-06-24 Tue
骨再生领域新进展：PDGFRβ标记骨膜多亚群间充质及周细胞的发现——解读《pdgfr marks distinct mesenchymal and pericyte populations within the periosteum with overlapping cellular features》一、研究背景与科学问题骨膜作为骨组织外层的薄层血管化组织，长期以来被认为是骨生长和修复中至关重要的细胞库。近年来，骨膜内间充质干/祖细胞（mesenchymal stem/progenitor cells, MSCs）的多样性与其在骨再生中的作用引发了广泛关注。多项研究已筛选出一系列骨膜祖细胞的表面标志物，包括CD73、CD164、PDPN、PDGFRα（platelet-derived growth factor receptor alpha）、Leptin receptor 和Nestin等，但这些标志物在功能异质性、细胞归属和再生效能上的异同尚无定论。
血管相关的细胞，尤其是微血管周细胞（pericytes），同样被证实具有多向分化潜能，并在骨修复中扮演重要角色。相关研究显示，来源于骨膜的CXCR4+周细胞在成骨能力上优于其他组织来源的周细胞，而血管化在骨修复中至关重要。现有文献还认为，骨膜周细胞的增殖和分化，为成骨祖细胞库提供补充。然而，骨膜周细胞和MSC之间的表型交叠、功能重叠、标志物区分及其各自的再生作用，长期未有明晰。
PDGFRβ（platelet-derived growth factor receptor β，血小板源生长因子受体β）是间充质祖细胞和周细胞常见的表面标志物，参与调控细胞增殖、迁移和存活。以往研究表明，PDGFRβ阳性细胞在骨折修复、骨稳态维持中具有重要成骨潜能。但在骨膜组织中，究竟有多少种细胞类型表达PDGFRβ？这些细胞是否有共同或独特的功能及分子特征？这些问题正是本文致力于解答的科学核心。
二、论文信息与作者团队本论文题为“pdgfr marks distinct mesenchymal and pericyte populations within the periosteum with overlapping cellular features”，为一篇原创性基础研究论文。主要作者包括Ziyi Wang, Qizhi Qin, Neelima Thottappillil, Mario Gomez Salazar, Masnsen Cherief, Mary Archer, Deva Balaji及Aaron W. James，主要作者均来自Johns Hopkins University（约翰斯·霍普金斯大学）Department of Pathology。论文发表于2025年4月16日，发表于Oxford University Press出版的《Stem Cells》（2025,卷43, sxaf020）。
三、研究设计与技术路线详解1. 研究对象与总体设计本研究聚焦于小鼠长骨骨膜，通过跨界整合单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）、转基因小鼠模型（Pdgfrβ-CreERT2; mT/mG reporter mice）、免疫组织化学、流式细胞分选、体外功能实验等手段，系统解析表达PDGFRβ的骨膜细胞亚群的多样性及其功能特征。
以下是研究主要流程及实验证明细节的详细叙述：
2. 单细胞转录组学分析(1) 采样与制备研究选用16周龄C57BL/6J雄性小鼠4只，分别取左侧股骨和胫骨骨膜细胞，酶消化后，用10X Genomics平台进行单细胞转录组文库制备，目标每个样本进入测序的细胞数为10,000。
用Cell Ranger与Seurat进行数据分析，严格过滤低质量细胞（基因数 >500且<8000，线粒体转录本<20%），SCTransform归一化和降维（UMAP），并采用KEGG等数据库进行通路富集。
(2) 主要分析与发现共获得4,042个单细胞转录组，有8个主要细胞簇被辨识，其中包括间充质细胞、周细胞、血管内皮、造血、免疫等亚群。PDGFRβ不仅广泛分布于周细胞簇，也在间充质细胞亚群中以30%-76%的频率表达。
详细分析间充质细胞亚簇M1-M5，发现PDGFRβ高表达与骨形成相关基因（如BGLAP、Spp1、Alpl、Ctsk）共表达。
GO和KEGG通路分析显示：PDGFRβ+细胞富集于增殖、粘附、成骨和软骨发育等生物过程，信号通路以PI3K-AKT、JAK-STAT和MAPK为主，而PDGFRβ-细胞则富于脂肪分化、血管生成等过程。
3. 转基因荧光标记小鼠空间定位分析利用Pdgfrβ-CreERT2;mT/mG小鼠，通过体内Tamoxifen诱导Cre重组，从而使表达PDGFRβ的细胞表达EGFP（绿色荧光蛋白），其余细胞表达tdTomato（红色）。对骨膜组织进行免疫荧光染色和组织切片，结合周细胞（CD146）、内皮细胞（Endomucin）、MSC（PDGFRα）、成骨细胞转录因子（Runx2）等标记进行共定位分析。
主要发现如下：
骨膜及骨髓中的周血管区和非周血管区均有PDGFRβ+细胞分布，EGFP信号在原发性松质高集中。
在骨膜CD146+细胞中有33%共表达PDGFRβ，在Endomucin+内皮细胞中也有47%PDGFRβ表达。
PDGFRα+和Runx2+细胞中亦有较高比例的PDGFRβ表达，提示PDGFRβ覆盖一批功能交叠但定位不同的前体细胞。
4. 流式分选及体外功能鉴定(1) 腺苷酰胺分选与分组分选去除CD31+（内皮）、CD45+（白细胞）及ter119+（红细胞前体）的骨膜细胞，依GFP及tdTomato荧光分为PDGFRβ+和PDGFRβ-群体，前者占约7%，后者约67%。
(2) 功能实验增殖能力：PDGFRβ+细胞MTS检测显示24h较PDGFRβ-细胞增殖增强60.8%，48h增幅为41.3%。
迁移能力：划痕迁移实验显示PDGFRβ+细胞迁移速率高出1.41倍。
成骨分化：诱导21天后，Alizarin Red S检测矿化结节，PDGFRβ+细胞成骨能力较对照增强2.14倍，相关成骨基因（Bglap、Sp7、Col1a1、Runx2）均上调。
干性基因（Nes、Ly6a）、周细胞标志（Mcam、Acta2）在PDGFRβ+细胞中显著高表达。
5. 双标志流式分选和亚群功能异质性分析依据CD146和PDGFRβ荧光强度将细胞进一步分为四亚群：PDGFRβ- CD146-、PDGFRβ- CD146+、PDGFRβ+ CD146-、PDGFRβ+ CD146+。分别检测各亚群的基因表达、增殖、克隆形成及成骨分化能力。
PDGFRβ+ CD146+群体增殖和克隆能力最强，克隆形成单元数量约为PDGFRβ- CD146+群体的4倍，较PDGFRβ+ CD146-也高出57.4%；克隆面积上PDGFRβ+ CD146-和PDGFRβ+ CD146+相仿。
成骨分化方面，PDGFRβ+ CD146-和PDGFRβ+ CD146+无明显差异，但二者成骨能力显著高于CD146-亚群。
周细胞典型标志（cspg4、rgs5）在PDGFRβ+ CD146-群体中表达明显低于PDGFRβ+ CD146+。
结果提示PDGFRβ+ CD146+代表增殖力最强、成骨能力高度富集的周细胞亚型。
四、主要研究结论与其意义综上，本研究发现：
小鼠骨膜中存在多亚群PDGFRβ+细胞，这些细胞既包括血管相关的周细胞群（主要为PDGFRβ+ CD146+），也包括非血管相关的间充质群体（PDGFRβ+ CD146-），二者在分子特征和功能上既有重叠又有分化。
PDGFRβ+细胞显示强烈的干/祖细胞特征与高度成骨能力，无论其是否同时表达CD146。
PDGFRβ+ CD146+周细胞为克隆形成和细胞增殖最具优势的亚型，而PDGFRβ+ CD146-间充质细胞则在成骨分化方面同样表现突出。
PDGFRβ+群体均可作为骨再生和组织工程的优质细胞来源，尤其在需血管化骨修复的临床应用前景广阔。
五、研究亮点与创新系统整合单细胞组学、空间定位与功能实验，首次全面揭示了骨膜PDGFRβ+细胞在空间、分子、功能、表型等多维度的异质性。
利用Pdgfrβ-CreERT2;mT/mG报告小鼠，结合流式分选方法，实现对成骨前体细胞高纯度亚群的筛选和功能比较。
明确区分了PDGFRβ+周细胞和间充质亚型在干性、增殖和成骨分化中的差异，为以PDGFRβ为标记的骨再生细胞提供了精准的理论基础。
六、科学与临床应用价值本研究为骨膜细胞异质性、干细胞生物学及骨组织工程奠定重要基础。临床上，基于PDGFRβ+细胞的血管化骨再生策略将在骨折修复、骨缺损、移植及组织工程中具有直接推动作用。此外，明确不同亚型前体细胞的功能特性，有助于优化细胞治疗骨再生的理论基础和实践手段。
七、作者团队贡献与致谢本研究由Ziyi Wang、Qizhi Qin、Neelima Thottappillil等人共同担任第一作者，Aaron W. James为通讯作者。项目获NIH/NIAMS、NIH/NIDCR、Maryland Stem Cell Research Foundation等多项基金资助，感谢Johns Hopkins University转录组、流式、显微等核心设施的技术支持。
八、延伸阅读与数据获取原始单细胞测序数据已上传GEO（编号：GSE272612）。
助读者可通过论文附加材料或与通讯作者联系获取更多实验详情。
九、总结本文综合运用前沿组学与细胞技术，厘清了骨膜PDGFRβ+细胞的异质性和功能特征，为骨再生基础研究及转化提供了重要理论依据和实验支撑。其科学价值和应用前景值得骨科、再生医学及干细胞领域持续关注。