成纤维细胞活化蛋白-α通过与CXCL12互作失活Wnt经典信号并调控成骨细胞分化

2025-06-24 Tue
成纤维细胞活化蛋白-α CXCL12 Wnt/β-连环蛋白通路成骨细胞分化脂肪细胞分化骨质疏松间充质前体细胞
学术研究背景随着全球人口老龄化加剧，骨质疏松症（osteoporosis）逐渐成为危害公共健康的重大疾病。它以骨量减少、骨组织微结构退化为特征，极易诱发骨折，严重影响老年群体生活质量，并带来巨大的医疗负担。骨质疏松症主要归因于骨吸收和骨形成的不平衡。尽管目前针对骨吸收相关机制的研究较多，相关治疗药物也陆续上市，但对骨形成失调、尤其是成骨细胞分化与调控机制的理解仍不充分，限制了新疗法的开发。因此，揭示支配成骨细胞（osteoblast）分化的细胞和分子机制，对阐明骨代谢疾病发生发展机制、发现新的干预靶点具有重要意义。
骨髓基质细胞（BMSCs，bone marrow stromal cells）是成骨细胞和脂肪细胞等多种细胞的前体。它们在特定微环境和细胞信号的调控下，可以分化为成骨细胞参与新骨形成，也可转化为脂肪细胞。BMSCs的分化命运不仅取决于多个信号通路的精确调节（如Wnt/β-catenin通路、RUNX2、Osterix、PPARγ等），其分化倾向的失衡也是骨质疏松等疾病发生的重要原因——例如向脂肪细胞分化的增加会抑制成骨，增加骨髓脂肪含量，间接削弱骨组织功能。这一过程中的具体分子调控机制尚不清楚，尤其是信号网络间的交互如何决定细胞命运。
近年来，成纤维细胞激活蛋白α（FAPα，fibroblast activation protein-α）作为一种表面丝氨酸蛋白酶（serine protease），逐渐被认为与骨代谢密切相关。初步报道显示，FAP具备双重酶活性（dipeptidyl peptidase和endopeptidase），不仅在组织修复、肿瘤、炎症等中发挥作用，且可能负调控成骨过程。然而，FAP是否直接调控骨髓基质细胞的成骨与成脂分化，以及这一过程的分子靶点和通路，依然缺乏系统和直接证据。
论文来源与基础信息本论文题为“Fibroblast activation protein- interacts with cxcl12 to inactivate canonical wnt signaling and regulate osteoblast differentiation”，由Yuan Dong、Xingli Hu、Wei Liu、Yinglong Hao、Jie Zhou、Xiaoxia Li和Baoli Wang等人完成，作者分别来自天津医科大学楚贤义纪念医院与内分泌研究所、天津医科大学基础医学院。该论文发表于Oxford University Press旗下的《Stem Cells》杂志（论文编号doi:10.1093/stmcls/sxaf027），于2025年6月收录在学术期刊的advance-article栏目。
研究整体流程与实验方法详述本研究以“小鼠骨髓基质细胞和成骨前体细胞”为模型，结合分子克隆、基因干扰（siRNA/shRNA）、过表达、免疫共沉淀、蛋白降解、功能性分化检测（成骨、成脂诱导及染色）、免疫印迹（Western blot）、转录组测序（RNA-seq）等一系列实验手段，系统探究了FAP在BMSCs分化过程中作用的分子机制。主要实验流程包括：
1. 细胞获取与分化模型建立对象与样本：采用3周龄C57BL/6J小鼠，分离获得骨髓基质细胞（BMSCs），并利用成骨前体细胞系MC3T3-E1、间充质细胞C3H10T1/2、鼠骨髓间充质细胞St2细胞。
分化诱导：通过成骨和成脂诱导剂分别诱导BMSCs、St2和C3H10T1/2细胞向成骨细胞和脂肪细胞方向分化。
分化检测：采用碱性磷酸酶（ALP）染色及活性检测、天青石红染色（Alizarin Red）评价矿化，油红O染色评价脂肪细胞分化。
2. FAP及其功能操作（Gain-of-function / Loss-of-function研究）过表达实验：利用pcDNA3.1(+)载体构建FAP基因表达载体，运用聚乙烯酰胺分子转染试剂将其转染入St2、MC3T3-E1、C3H10T1/2等细胞，建立FAP过表达模型。
基因敲降实验：合成特异性siRNA/shRNA针对FAP进行转染或以慢病毒法感染BMSCs，实现FAP基因敲降。
检测体系：对比分析FAP表达对BMSCs成骨/成脂分化的具体影响，结合qPCR与Western blot检测成骨/成脂分化标志基因（如RUNX2、Osterix、ALP、Osteopontin、PPARγ、C/EBPα、FABP4、Adipsin等）表达。
3. 分子机制探索生物信息学与共沉淀：通过STRING数据库预测FAP潜在互作蛋白，发现CXCL12（C-X-C基序趋化因子配体12）为焦点靶标。随后，通过共免疫沉淀（Co-IP）实验证实FAP与CXCL12蛋白存在直接结合。
蛋白降解实验：利用体外重组蛋白体系，分析FAP能否直接裂解降解CXCL12蛋白，评估分解的效率和时间依赖性。
蛋白表达调控水平鉴定：检测FAP过表达或敲降后CXCL12蛋白、mRNA水平变化，明确调控层级主要在蛋白质水平。
4. Wnt/β-catenin信号通路分析信号通路活性监测：检测关键Wnt通路元件（磷酸化LRP6、磷酸化GSK3β、非磷酸化β-catenin、TCF7L2等）蛋白表达，阐明FAP与CXCL12调控Wnt/β-catenin信号的方式及其调控分化命运的作用链条。
化学抑/激活剂与基因双敲研究：应用GSK3β抑制剂CHIR99021促进β-catenin活性，或结合β-catenin和FAP/CXCL12双siRNA/表达质粒，验证FAP/CXCL12对Wnt/β-catenin信号及下游分化作用的直接性。
5. FAP蛋白酶活性功能探究活性点突变实验：定点突变FAP位点（S624A），获得蛋白酶失活型FAP（FSM），对比其与野生型FAP在CXCL12蛋白水解与分化调控中的作用差异，明确酶活对该调控轴的必要性。
6. RNA-seq全转录组测序实验设计：对siRNA沉默FAP和CXCL12的St2细胞分别进行全转录组测序，分析两者共同与差异调控的基因集与信号通路。
数据分析：KEGG和GO功能富集分析，揭示差异通路及分子网络联系，增强对FAP-CXCL12-Wnt信号轴调控网络的理解。
主要实验结果详述1. FAP表达与分化命运相关性FAP在BMSCs成骨与成脂分化过程中表达显著上调，在小鼠骨、骨骼肌组织中表达高，且老年小鼠骨组织中FAP表达进一步增强，提示其可能与骨代谢疾病相关。
2. FAP影响BMSC分化命运成骨分化：FAP过表达明显抑制St2和MC3T3-E1等细胞成骨分化，表现为ALP染色、矿化程度降低，成骨相关基因表达下调。相反，FAP敲降/沉默可促成骨分化。
成脂分化：FAP过表达促进C3H10T1/2等细胞脂肪分化，油红O染色增强，脂肪相关基因表达上调；FAP下调则抑制脂肪分化。
在原代BMSCs进一步验证，FAP敲降实现促进成骨、减少成脂分化的双向调节。
3. FAP靶向降解CXCL12影响信号通路FAP与CXCL12蛋白形成复合体，可直接裂解降解CXCL12蛋白，且对其mRNA无影响，调控层次明确在蛋白质水平。
在体外纯化重组体系中，FAP可显著并随时间递增地降解CXCL12。
CXCL12本身激活经典Wnt/β-catenin信号，促进成骨分化，抑制脂肪分化；而FAP的蛋白酶活性失活型（FSM）未能降解CXCL12，也失去对BMSCs分化的调控作用。
4. FAP、CXCL12与Wnt/β-catenin通路调控成骨及成脂分化FAP上调使Wnt/β-catenin信号相关蛋白（p-LRP6、p-GSK3β、非磷酸化β-catenin、TCF7L2）表达下调，对应成骨抑制、成脂促进作用；FAP下调或CXCL12过表达则表现为上述信号上升。
CHIR99021激活β-catenin可逆转FAP对分化倾向的异常影响，β-catenin siRNA也可使FAP/CXCL12对分化命运调控削弱或消失，证明该信号通路在其中的核心地位。
5. CXCL12在FAP调控分化中的作用及协作关系CXCL12的表达调控对BMSCs分化具有决定性作用，其下调抑制成骨、促进成脂分化，上调则相反。
CXCL12 siRNA可部分逆转FAP siRNA激发的成骨促进、成脂抑制作用。
反之，CXCL12过表达也可部分抵消FAP过表达导致的成骨抑制、成脂增强效应。
6. RNA-seq揭示转录组侧的调控网络沉默FAP或CXCL12后分别检测到逾千个差异基因，虽共同调控通路有限（如NOD样受体、p53、TLR等），但KEGG未检出Wnt/β-catenin信号为下游主要通路，提示FAP/CXCL12调控Wnt信号主要是转录后水平。
研究结论与科学价值研究明确指出，FAP通过直接裂解CXCL12蛋白，抑制其促进Wnt/β-catenin信号活性的功能，由此实现对间充质前体细胞成骨/成脂分化命运的关键调控。具体而言，FAP上调时抑制Wnt信号，促使BMSCs向脂肪细胞分化且抑制成骨细胞分化；FAP降低则激发成骨过程，抑制脂肪分化。该信号轴的发现，为理解骨髓脂肪与成骨“此消彼长”提供了新的分子解释，也为骨质疏松等代谢性骨病的干预提供了重要的潜在靶点。抑制FAP表达或活性有望作为未来防治骨质疏松症的新策略。
研究亮点机制创新：首次明确了FAP通过直接水解CXCL12调控Wnt/β-catenin信号和BMSCs分化命运的完整机制，填补了FAP参与成骨调控的直接证据空白。
方法学严谨：研究采用了细胞实验、体外蛋白反应、动物组织检测、分化染色、分子互作、信号分析与全转录组测序等多维度创新与组合，结论可靠。
蛋白酶活性必需性：通过定点突变设计，证实FAP酶活对CXCL12裂解及功能调控不可或缺，为进一步设计特异性FAP抑制剂提供参考。
潜在临床价值：靶向FAP或CXCL12可能成为改善骨髓“脂-骨”平衡、阻止或逆转骨质疏松的新方向。
其它有价值内容本研究也提到FAP相关通路的调控机制和转录组改变超出Wnt通路，提示其还可能通过更多层面影响骨、脂代谢。
论文团队此前发现，组蛋白去甲基化酶KDM7A通过调控FAP转录影响骨稳态，暗示表观遗传与酶调控在骨代谢轴中的协同作用，拓展了骨生物学网络理解。
结语及意义本研究揭示了FAP-CXCL12-Wnt/β-catenin新信号轴在骨髓间充质细胞分化决策中的桥梁作用，为骨代谢疾病基础机制、目标验证与药物开发提供了崭新思路。未来如能在动物模型和临床样本中进一步证实该轴的生理病理意义，将极大丰富骨生物学理论体系，推动骨质疏松等相关疾病基础与转化医学研究。