成人人体心脏细胞外基质通过促进线粒体和代谢成熟改善人源iPSC-心肌细胞功能

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心脏细胞外基质 iPSC-心肌细胞 功能成熟 线粒体成熟 代谢成熟 细胞治疗

一、学术背景介绍

心血管疾病，尤其是心肌梗死（myocardial infarction, MI），是全球范围内导致死亡和致残的首要疾病之一。心肌梗死发作后，患者心脏内可在短短数小时中损失高达10亿个心肌细胞(cardiomyocyte, CM)。然而，成年心肌组织本身再生能力极低，这导致心脏无法依靠自我修复来逆转细胞损失，从而引发心力衰竭及一系列严重后果。为此，研究人员在过去十余年间积极探索基于细胞替代的新型治疗策略，希望通过“种植”外源心肌细胞以重建受损心脏结构与功能。

与体细胞直接移植相比，诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell, iPSC）及其衍生的心肌细胞（iPSC-derived cardiomyocyte, iCM）因其理论上可无穷扩增、不易产生免疫排斥反应且来源丰富，成为极具前景的心脏再生医学方案。然而，现有的iPSC分化方案主要只能得到类似于胎儿心肌细胞的“幼稚型”iCM，这些细胞在结构、代谢、功能等方面均显著弱于成人心肌细胞，极大地限制了其在再生治疗、疾病模型和药物筛选中的临床转化。

既往针对iCM成熟的促进手段涵盖了长期培养、机械与电刺激、化学诱导因子等，但成熟度提升有限，且方法实施复杂耗时。近年来，有学者提出利用“基质微环境（extracellular matrix, ECM）记忆”来指导干细胞分化和功能成熟的新思路。已发现ECM并非仅为细胞的被动支架，更具有特定发育阶段和组织种类的“记忆”，能通过整合信号、分子调控及物理属性等多重途径影响细胞命运。

基于此，本文作者团队关注到：如果能利用成人人体心脏来源的去细胞化ECM（decellularized extracellular matrix, dECM）在iPSC分化前期作为“预调理”环境，或许可更有效地“诱导”iPSC朝向心肌谱系分化，并推动其向更接近成人水平的功能和代谢成熟。这一创新思路直接回应了当前iCM应用中的最大“瓶颈”——功能和代谢未成熟，是再生心脏医学领域的重要科学难题。

二、论文来源介绍

本项研究题为《adult human heart extracellular matrix improves human ipsc-cm function via mitochondrial and metabolic maturation》。论文由S. Gulberk Ozcebe、Mateo Tristan及Pinar Zorlutuna等完成，所有作者主要隶属于美国University of Notre Dame（生物工程、化学/生物分子工程和航空航天/机械工程等学院），并有部分作者来自美国国家环境健康科学研究所（NIEHS）。本文发表于2025年《Stem Cells》（Vol. 43, No. 5, Article ID sxaf005, DOI: 10.1093/stmcls/sxaf005），为该领域的最新原创性科学研究成果。

三、研究详细流程与技术路线

1. 研究对象与总体设计

本研究利用来源于三份30-50岁成人捐赠者（心脏移植不可用、去身份信息处理）的左心室心肌组织作为ECM原材料。主要研究流程包括以下几个核心环节：

  • （1）成人心脏ECM的制备与表征
  • （2）人体iPSC的培养、ECM预处理及心肌分化
  • （3）iCM的成熟度评价（功能、代谢、基因表达等）
  • （4）探究ECM促进作用的可能分子机制/组分
  • （5）数据分析与统计检验

2. 详细实验方法

2.1 成人心脏ECM的制备与表征

自三份30-50岁成人捐赠心脏获取左心室肌标本，切片（ mm），经以下步骤去细胞化：

  • 去脂+脱细胞：1%十二烷基磺酸钠（SDS）水浴24小时+1% Triton X-100 30分钟，去除细胞结构及脂肪成分。
  • DNA去除：50 U/mL DNase水浴8小时，最终经去离子水冲洗。
  • 处理后ECM冻干、液氮研磨成粉末，经胃蛋白酶水解、离心取上清再调pH至中性，获得溶液化ECM。ECM蛋白总量经Rapid Gold BCA定量后稀释至0.01 mg/ml（1×）和0.05 mg/ml（5×）两种实验浓度。

另有一套“保护胞外囊泡(extracellular vesicle, EV)完整性”的去细胞化方案，用于后续分组对照。

  • 成分分析：通过质谱(Mass Spectrometry, MS)对ECM蛋白组份进行鉴定与定量，具体比较不同年龄人心脏（青年、成人、老年）中ECM蛋白的丰度，重点关注功能相关的高低丰度蛋白（如胶原、糖蛋白、蛋白聚糖等）。

2.2 iPSC培养、ECM预调理与心肌分化

选用来源于Harvard Stem Cell Institute的dips 1016 seva人皮肤成纤维细胞iPSC系，在1% Geltrex包被板上维持培养。当iPSC达80%-85%融合度时，分批进行如下实验处理：

  • ECM预调理：于iPSC分化前五天，分别以0.01 mg/ml、0.05 mg/ml ECM溶液或等量EV对培养基进行补充，并每日更换。相比对照组（未加任何ECM）。
  • 经典心肌诱导：利用WNT通路抑制剂（CHIR99021+IWP-4）等分子，实现iPSC向心肌谱系分化，随后换B-27+RPMI培养至分化30天，即获得iCM群体。

2.3 成熟度与功能评价

  • 细胞功能表型：采用显微拍摄与Matlab自编算法量化iCM自发收缩（录制视频、图像块追踪、速度/幅度/区域统计）；荧光染料Fluo-4 AM检测Ca²⁺瞬变，进一步检验细胞电生理特性、药理（异丙肾上腺素刺激）敏感性。
  • 线粒体网络结构：MitoTracker染色结合高分辨共聚焦显微成像，ImageJ mitochondria analyzer插件分析线粒体覆盖面积、分支数、网络节点等指标。
  • 细胞能量代谢状态：Agilent Seahorse XF96能量代谢分析仪，测定氧消耗率(OCR)、细胞外酸化率（ECAR），算法计算糖酵解与氧化磷酸化各态下的ATP产量、能量表型等。
  • 基因表达谱检测：RT-qPCR与Nanostring技术定量心肌结构和功能相关基因（MYH6、MYH7、TNNT2、ATP2A2等），并用GAPDH做内参归一化。
  • 统计分析：所有实验三次及以上重复，数据用均数±标准差（SD）呈现，采用单因素方差分析（ANOVA）及Tukey’s多重对比检验，P<0.05为显著。

2.4 ECM功效机制探究

  • ECM加热/声处理分组：用80℃水浴3小时热变性消除蛋白结构功能，对比基础ECM与热处理ECM对iPSC分化的促进差异；ECM声破碎用于释放伴随囊泡，比较与直接补充纯分离EV的作用。比较两种去细胞化策略（SDS、PAA）下EV保存效果。
  • 多组比较：通过上述功能、结构、代谢等各类测定，系统澄清ECM组分中何者主要贡献于iCM成熟增强效应。

3. 数据分析方法

  • 实验数据自动化采集与分析，包括Matlab自建块匹配算法追踪细胞跳动、Fluorescence时程自动提取Ca²⁺峰值与滞后、ImageJ插件批量统计线粒体骨架网络，各项生理与分子指标均有定量化数据输出，确保分析标准化与客观性。

四、主要实验结果与逻辑推理

1. 去细胞化成人心脏ECM质量确证

三份30-50岁成人左室心脏组织经上述多步去细胞-去脂-去DNA工艺处理后，组织学切片（H&E、Masson’s trichrome）显示细胞成分完全消失而ECM结构完整。DNA残留<50 ng/µl, 符合标准。质谱鉴定发现，成人ECM中大部分为I型、III型、VI型胶原蛋白（占比逾50%），还检测到银黏蛋白(fibronectin)、纤维蛋白素、Perlecan(HSPG2)、Galectin-1等心脏发育和功能相关的糖蛋白/蛋白聚糖。

2. ECM预处理显著增强iPSC心肌分化及功能成熟

经成人ECM预处理的iCM群体，分化第30天时（对比对照组）：

  • 表型：流式检测心肌标志蛋白（cTnT, cardiac troponin T）阳性率由80.9%增至92.2%；成纤维细胞标志物Vimentin表达显著下降。
  • 收缩功能：高剂量ECM组自发跳动频率和速度均显著提高，热图显示收缩呈类组织同步化分布；在等面积抖动下ECM组表现出更高力学活性。Isoproterenol药理刺激下，峰间时距缩短，敏感性提升。
  • 电生理成熟：高剂量ECM组iCM呈现典型的室型心肌动作电位曲线（出现“shoulder”，晚期平台期延长），APD90显著延长。
  • 线粒体网络：ECM组iCM细胞内线粒体面积与覆盖率升高，线粒体由球形/片段化向长条/分支/网络化方向演变，分支节点/交点成倍增加，表明能量代谢装置高度成熟。
  • 代谢状态：能量谱图显示ECM组细胞呈现更高基底ECAR与OCR，ATP整体产量及有氧呼吸能力提升，糖酵解储备与氧化磷酸化均增强，提示由胎儿型低代谢向成人心肌高能量代谢转变。
  • 转录组表现：心肌成熟标记基因MYH7、TNNT2、ATP2A2在ECM组表达量显著上调，MYH7/MYH6比值上升（表明心肌功能类型转变）；细胞增殖和胎儿型基因（如CTGF、NKX2-5、ACTA1、NPPA等）被下调，提示成熟度提升。细胞凋亡相关基因（CASP3、CASP9、BAX、BCL2L1）表达降低，ECM具有一定“保护”作用。
  • 机制解析：热变性ECM组，跳动和能量表现下降，线粒体网络化损失，提示大量蛋白（如胶原、某些生长因子）对结构影响更大但非功能主导；ECM囊泡组与声处理组某些指标趋近，说明ECM中结合囊泡（EVs）成分对部分能量与成熟有贡献，但亦非绝对决定因素。

3. ECM促进效应多组分协作而非单一成分主导

结合质谱和各实验分组结果，成人心脏ECM成分众多且涉及多环节调控，既有胶原/糖蛋白等大分子骨架，也有生长因子、糖胺聚糖、囊泡、糖类结合蛋白等。作者指出，单纯蛋白变性无法完全抑制促进作用，暗示ECM上装饰性小分子（如多糖/GAGs、HSPGs）及其结合的信号分子和外泌体物质在发挥关键协同效应。因此，“基质记忆”在促进人iPSC分化-成熟过程中远非单一通路。

五、结论及意义

本研究提出并验证了“成人心脏来源ECM-预调理”可显著提升iPSC神经心肌分化的“成熟度”，主要体现在：

  • 结构上，诱导获得更多、更成熟的心肌细胞；
  • 功能上，自发与药物刺激下收缩与电生理行为更接近成人心脏；
  • 能量代谢上，线粒体网络发育良好，能量产出和结构支撑力更强，糖酵解与氧化磷酸化动态适应能力增强；
  • 分子层面，结构和功能基因表达谱更加“成人化”，凋亡及未成熟特征下调；
  • 多组分、多层次调控，强调完整基质微环境较单组分蛋白更具协同效果。

科学与应用价值

  • 科学意义：首次系统揭示了人源成人心脏ECM直接促进iPSC心肌分化成熟的功能-结构-能量-分子关联网络，对“组织记忆”理论与干细胞外源诱导新机制提供实验证据。
  • 应用前景：该方案操作便捷、成本低廉（5天预处理即可），有望广泛应用于心脏再生治疗、疾病模型、药物筛选等领域，最大程度缓解iCM未成熟短板，为未来个体化再生医学生治疗心梗等心血管疾病提供理论与技术基础。
  • 亮点与创新：1）新颖的“预调理+诱导分化”一体化流程；2）首次系统比较ECM各组分/修饰方式对心肌分化与成熟影响；3）结合多组学证据剖析“结构——功能——能量”一体化成熟过程，为相关领域提供了可模板范式。

六、补充与展望

  • 该研究目前仅基于单一人iPSC细胞系，未来如能多系验证可推广性和有效性将更高。
  • 研究未与其他“异种”ECM直接比较，但文献提及人/猪心脏基质组成极为接近，未来亦可为大规模商业开发提供理论支持。
  • 研究尚未系统评价脂肪酸与TCA循环等脂代谢通路在ECM诱导分化中的作用，结合其他报道推测脂肪酸补充亦可进一步提高iCM成熟度。
  • 该项新策略还为3D打印、器官芯片等领域实现更真实、功能更强的“体外心脏”提供基石。

七、总结

S. Gulberk Ozcebe等于Stem Cells杂志发布的该项研究，为基于iPSC的心脏再生医学攻克“未成熟心肌”这一世界性难题提供了切实可行的新策略。成人人心脏ECM通过其复杂且记忆化的分子网络，能够显著、高效地诱导iPSC向功能与代谢均更接近“成体化”的心肌细胞转化，该作用不仅限于蛋白，囊泡、多糖、糖蛋白诸成分亦有关键贡献。该方法将极大加速iCM在心脏再生治疗、疾病建模、药物筛选等领域的标准化成熟化进程，也为未来解析ECM主导下高阶细胞命运决定、跨物种应用、组织工程等前沿研究树立了宝贵范式。