Effets protecteurs rénaux de la protéine 6 induite par le facteur de nécrose tumorale α encapsulée dans des vésicules extracellulaires dérivées de cellules souches mésenchymateuses

I. Contexte de la recherche et signification académique

Ces dernières années, l’incidence de l’insuffisance rénale aiguë (acute kidney injury, AKI) n’a cessé d’augmenter dans le monde entier. L’AKI entraîne non seulement une perte aiguë de la fonction rénale, mais il est de plus en plus prouvé qu’il est étroitement lié à l’apparition et au développement de la maladie rénale chronique (chronic kidney disease, CKD). De nombreuses études épidémiologiques et fondamentales ont montré qu’une proportion significative de patients atteints d’AKI finissent par progresser vers une CKD, posant ainsi le défi clinique de la « progression d’AKI vers CKD ». Les principales problématiques de recherche dans ce domaine comprennent la réaction inflammatoire, la raréfaction microvasculaire, la réponse hypoxique, le signal du facteur de croissance transformant β1 (TGF-β1, transforming growth factor β1) et la transition épithélio-mésenchymateuse, tous ces processus coopérant à la progression de la fibrose interstitielle rénale, qui constitue le point final commun de la CKD.

À l’heure actuelle, il n’existe pas de traitement efficace pour bloquer ou inverser la progression d’AKI vers CKD. Développer de nouvelles stratégies d’intervention est devenu une priorité à percer dans le domaine des maladies rénales. Les cellules souches mésenchymateuses (mesenchymal stem cells, MSCs), en raison de leur large fonction d’immunorégulation et de réparation tissulaire, sont considérées comme une méthode thérapeutique très prometteuse pour traiter les lésions rénales, réduire l’inflammation et inhiber la fibrose. Des recherches récentes montrent que l’effet thérapeutique des MSCs découle principalement de la sécrétion de différents facteurs actifs (le « secretome »), lesquels incluent des protéines solubles, des acides nucléiques, des lipides et des molécules encapsulées dans les vésicules extracellulaires (extracellular vesicles, EVs).

Parmi les nombreux facteurs sécrétés connus par les MSCs, la protéine 6 induite par le facteur de nécrose tumorale α (tumor necrosis factor-α induced protein 6, TSG-6) s’est avérée posséder une activité anti-inflammatoire et anti-fibrotique exceptionnelle, jouant un rôle central dans divers modèles de lésions tissulaires. Cependant, les mécanismes de sécrétion de TSG-6 par les MSCs, son mode d’action et la façon d’optimiser sa sécrétion/son transport restent largement méconnus à ce jour. Cette étude s’attache à ces questions de pointe, se concentrant sur le rôle de TSG-6 dans la transition AKI-CKD, selon une approche pour déchiffrer ses mécanismes d’action et de sécrétion, et explorer de nouvelles stratégies pour augmenter sa sécrétion, afin d’apporter un fondement théorique et expérimental à la traduction clinique.

II. Source de l’article et informations sur les auteurs

L’article est intitulé « Renal protective effects of extracellular vesicle-encapsulated tumor necrosis factor-α-induced protein 6 derived from mesenchymal stem cells ». Les auteurs incluent Keisuke Morimoto, Ayumu Nakashima, Naoki Ishiuchi, Kisho Miyasako, entre autres, principalement affiliés à l’Université d’Hiroshima (Hiroshima University) et à la Twocells Company. L’article a été publié le 18 avril 2025 sous forme de recherche originale (Original Research) dans la revue « Stem Cells », volume 43, numéro 5, 2025 (DOI : 10.1093/stmcls/sxaf022).

III. Conception globale de l’étude et description détaillée du workflow expérimental

1. Aperçu du processus expérimental

Le point de départ de cette recherche repose sur les MSCs. Grâce à des approches de génie génétique et de traitement chimique, l’expression/l’encapsulation de TSG-6 dans les MSCs et leurs EVs a été renforcée. Les effets anti-inflammatoires et anti-fibrotiques ont ensuite été systématiquement évalués chez un modèle de rat d’ischémie-reperfusion rénale aiguë (ischemia-reperfusion injury, IRI). L’expérimentation se divise en trois volets : expériences moléculaires et cellulaires in vitro, intervention sur modèle animal et vérification des mécanismes, avec intégration de cytométrie en flux, biologie moléculaire, immunohistochimie, etc. L’organisation est hiérarchisée et innovante.

2. Détail des étapes expérimentales

a) Construction de MSCs surexprimant TSG-6

• Objet et méthode : Des MSCs humaines issues de la moelle osseuse (fournies par le RIKEN BRC) ont été cultivées dans des conditions standard et transfectées par un vecteur adéno-associé (adeno-associated virus, AAV) transportant TSG-6 (nom génétique : TNFAIP6) pour obtenir des MSCs surexprimant TSG-6 (TSG-6 MSCs). Le groupe contrôle (Null MSCs) a reçu un vecteur AAV vide.
• Point novateur : Le recours à l’AAV pour la modification génétique garantit davantage de sécurité par rapport à d’autres vecteurs viraux, et l’optimisation du MOI (multiplicity of infection) assure une expression stable et élevée du TSG-6 mRNA.

b) Préparation des EVs et du milieu conditionné

• Procédure : Les surnageants de culture de MSCs subissent des centrifugations successives (300×g, 2000×g pour éliminer les débris), puis une ultracentrifugation à 189 600×g pour l’extraction des EVs. Les EVs issues des TSG-6 MSCs et des Null MSCs sont ainsi notées respectivement TSG-6 MSC-EVs et Null MSC-EVs. Les milieux conditionnés (CM) de ces deux types de MSCs sont également collectés pour les expériences suivantes.
• Contrôle de qualité : L’analyse par cytométrie en flux et western blot des marqueurs spécifiques d’EVs (CD9, CD63, CD81), ainsi que la caractérisation par analyse de taille (nanoparticules) et microscopie électronique à transmission assurent la qualité, la taille et la morphologie des vésicules.

c) Modèle animal et interventions

• Sujet expérimental : Rats mâles Sprague–Dawley (SD) de 8 semaines, soumis à une ischémie du rein gauche durant 1 heure suivie d’une reperfusion pour établir un modèle IRI. Groupes : chirurgie Sham, contrôle PBS, Null MSC, TSG-6 MSC, I3C MSC (dernier groupe traité chimiquement, voir suite).
• Mode d’intervention : Après reperfusion, injection intra-aortique abdominale de 5×10^5 MSCs (ou de PBS). Les animaux sont sacrifiés aux jours 7 et 21 pour prélever les reins gauches et évaluer inflammation et fibrose.

d) Induction chimique d’une expression accrue de TSG-6

• Méthode et innovation : Sélection de l’indole-3-carbinol (indole-3-carbinol, I3C, présente dans des plantes comme le brocoli), un agoniste du récepteur des hydrocarbures aromatiques (aryl hydrocarbon receptor, AHR), ajouté au milieu de culture des MSCs afin d’activer et d’augmenter l’expression de TSG-6. Après optimisation dose-dépendante, une concentration sûre et efficace de 200 μM est retenue.

e) Expériences fonctionnelles in vitro

• Polarisation des macrophages : Les monocytes THP-1 sont différenciés en macrophages, ensuite exposés à différents CM ou EVs. L’expression de CD163 (marqueur M2) et CD11c (marqueur M1) est détectée par western blot ou cytométrie en flux.
• Induction de lymphocytes T régulateurs : Les cellules CD4+ naïves isolées du sang périphérique humain sont traitées avec le milieu conditionné MSC, puis l’expression de Foxp3 est mesurée en western blot pour évaluer la proportion de Treg.
• Expérience de knock-down de TSG-6 : Transfection des cellules par siRNA combinée à un traitement I3C afin de vérifier le rôle clé de l’expression de TSG-6.

f) Analyses tissulaires et moléculaires

• Immunohistochimie et coloration de la fibrose : Coupe de tissus rénaux, analyse immunohistochimique (α-SMA, Collagène I, CD3, CD68, CD163, Foxp3) ; évaluation de la fibrose interstitielle par la coloration trichrome de Masson.
• Détection moléculaire : qPCR en temps réel et western blot pour l’expression de TSG-6, TGF-β, α-SMA, Rap1 et autres marqueurs.

3. Caractéristiques et innovations méthodologiques

• Surexpression ciblée de TSG-6 dans les MSCs par AAV : stabilité et sécurité accrues
• Régulation par le petit composé I3C de la sécrétion de TSG-6 par les MSCs : fort potentiel clinique
• Analyse systématique du rôle de support des EVs pour TSG-6 et élucidation du mécanisme « EVs-TSG-6-immunorégulation »
• Validation multi-échelle (cellulaire, moléculaire, animale) ; démarche mécanistique rigoureuse et organisation expérimentale logique

IV. Résultats principaux détaillés

1. TSG-6 est sécrété principalement dans les vésicules extracellulaires

L’étude montre que l’élévation du mRNA TSG-6 obtenue par surexpression AAV dans les MSCs n’aboutit pas à une accumulation apparente de protéine TSG-6 intracellulaire ; les taux extracellulaires libres de TSG-6 restent sous le seuil de détection de l’ELISA. Cela indique que TSG-6 est principalement sécrété rapidement vers l’extérieur sous forme d’EVs par les MSCs, et non stocké dans le cytoplasme. La concentration de TSG-6 dans les EVs augmente au fil du temps, tandis que celle dans la cellule reste stable.

2. La surexpression de TSG-6 ne modifie pas les caractéristiques fondamentales des MSCs

La cytométrie en flux et l’évaluation du potentiel de différenciation montrent que la surexpression de TSG-6 n’altère pas le phénotype de surface (CD29/CD44/CD73/CD90, etc.) des MSCs ni leur capacité d’adipogenèse ou d’ostéogenèse, ce qui garantit la préservation de leurs propriétés essentielles à l’usage thérapeutique.

3. Les TSG-6 MSCs inhibent de façon significative la fibrose rénale dans le modèle animal

Dans le modèle de rat IRI, l’injection de TSG-6 MSCs entraîne une inhibition significativement plus marquée de l’expression de TGF-β et d’α-SMA dans le tissu rénal, comparée aux Null MSCs. Les analyses par Masson et l’immunohistochimie démontrent que les surfaces de fibrose, ainsi que les zones positives au collagène I et à l’α-SMA, diminuent de façon statistiquement significative, montrant que TSG-6 renforce l’effet antifibrotique des MSCs.

4. Les TSG-6 MSCs réduisent l’infiltration des cellules inflammatoires et favorisent la régulation immunitaire

Les résultats montrent que le groupe TSG-6 MSC présente un nombre réduit de lymphocytes T (CD3) et de macrophages (CD68) infiltrés dans le rein, tandis que les macrophages M2 immunosuppresseurs (CD163) et les lymphocytes T régulateurs (Foxp3) augmentent. Cela suggère que TSG-6 inhibe l’inflammation tout en favorisant la tolérance immunitaire.

5. Vérification du rôle régulateur des EVs de TSG-6 sur les cellules immunitaires

In vitro, les EVs riches en TSG-6 augmentent l’expression de CD163 sur les macrophages et diminuent celle du marqueur M1 (CD11c), favorisant leur polarisation vers le phénotype M2 immunosuppresseur ; le CM dépourvu d’EVs perd cet effet. Le milieu conditionné enrichi en TSG-6 renforce la conversion des cellules T CD4+ naïves en Treg Foxp3+, démontrant le rôle clé de TSG-6 dans la reconfiguration du microenvironnement immunitaire.

6. L’I3C augmente l’expression de TSG-6 dans les MSCs et renforce son activité antifibrotique

L’agoniste de l’AHR, l’I3C, induit une augmentation dose-dépendante du mRNA TSG-6 dans les MSCs. Après traitement à concentration sûre, ces MSCs présentent in vivo une action antifibrotique et anti-inflammatoire supérieure à celle des MSCs non traitées, tels que la réduction de l’α-SMA, du collagène I et la fibrose tissulaire. L’inhibition spécifique de TSG-6 annule les bénéfices observés, ce qui valide la fonction centrale de TSG-6.

7. Analyse de l’activité paracrine et évaluation de la sécurité

La protéine Rap1, essentielle au maintien de la fonction paracrine des MSCs, ne varie pas de façon significative après traitement AAV ou I3C, ce qui prouve que ni les modifications génétiques ni chimiques n’altèrent l’activité thérapeutique intrinsèque des MSCs.

V. Conclusions et portée profonde

Cette étude démontre systématiquement que :

1. TSG-6 est un médiateur clé des effets des MSCs, principalement sécrété sous forme encapsulée dans des EVs, agissant directement sur les cellules immunitaires pour inhiber l’inflammation et la fibrose.
2. L’augmentation de l’expression de TSG-6 (par ingénierie génétique ou induction par I3C) renforce de façon significative l’efficacité thérapeutique des MSCs, ce qui ouvre la voie à des approches de thérapie cellulaire MSC plus standardisées et efficaces.
3. L’axe « EVs-TSG-6 » propose un nouveau mécanisme moléculaire de régulation des maladies et représente une nouvelle cible potentielle pour la fibrose rénale et les maladies immunitaires.
4. L’I3C, en tant que petite molécule sûre et peu coûteuse, possède un potentiel d’application à grande échelle et à forte accessibilité, et apporte une nouvelle voie pour la traduction clinique et l’intervention personnalisée des MSCs.

VI. Points forts et caractéristiques de la recherche

• Mise en évidence claire du rôle central de l’encapsulation de TSG-6 dans les EVs
• Amélioration de l’efficacité thérapeutique des MSCs via stratégies AAV et I3C : innovation transposable
• Décryptage direct du rôle d’EVs-TSG-6 dans la polarisation des macrophages et l’induction des Treg, enrichissant les mécanismes immunorégulateurs
• Système expérimental multi-échelle et pluridisciplinaire, à haute valeur théorique et application
• Fondement technologique et théorique pour la standardisation et la production de masse de MSCs efficaces et de leurs EVs, comblant le manque de méthodes de contrôle de qualité face à l’hétérogénéité et la variabilité des lots

VII. Autres informations importantes

• Certains résultats de cet article ont été présentés lors du congrès annuel de l’American Society of Nephrology.
• L’équipe de recherche collabore avec la Twocells Company et a bénéficié de financements japonais pour cette étude.
• Les documents complémentaires et les jeux de données détaillés peuvent être fournis par l’auteur correspondant sur demande raisonnable.

VIII. Évaluation générale et perspectives

Cette étude élucide non seulement, sur le plan fondamental, un nouveau modèle selon lequel TSG-6 est sécrété par les MSCs et encapsulé dans les EVs pour exercer des fonctions de régulation immunitaire et anti-fibrose, mais fournit aussi des stratégies concrètes pour promouvoir la thérapie cellulaire MSC/EVs en clinique, ainsi qu’un ciblage thérapeutique innovant. L’optimisation de la qualité des MSCs et de la teneur en TSG-6 par le double recours à l’AAV et à l’I3C ouvre la voie à la normalisation et à la production à grande échelle. Cette avancée contribue significativement à contrôler l’hétérogénéité cellulaire, clarifier les mécanismes d’action et normaliser les applications cliniques. Elle représente une étape majeure pour le développement de nouvelles solutions contre les maladies rénales, en particulier la prévention et le traitement de la progression AKI-CKD, avec une valeur d’application et de diffusion très large.