高渗应激通过TRPML通道依赖的细胞内Ca2+信号促进肾小管上皮细胞中TFEB的核转位

2025-04-20 Sun
高渗应激转录因子EB (TFEB) 钙调神经磷酸酶 TRPML1 肾小管上皮细胞
近年来，细胞自噬（autophagy）作为一种重要的细胞内降解和回收机制，在维持细胞稳态和应对各种应激条件中发挥着关键作用。特别是在肾脏近端小管上皮细胞中，自噬活动对于应对缺血、毒性损伤和炎症等常见肾脏损伤至关重要。然而，尽管自噬在细胞应激适应中的作用已被广泛研究，但关于高渗应激（hyperosmotic stress）如何诱导自噬的分子机制仍不明确。高渗应激作为一种机械应力，能够通过改变细胞内外渗透压差影响细胞功能，但其具体如何调控自噬通路仍是一个未解之谜。
转录因子EB（TFEB）是自噬-溶酶体通路的主要转录调节因子，它通过调控自噬和溶酶体相关基因的表达来促进自噬。TFEB的活性受磷酸化事件的调控，当其去磷酸化时，TFEB会从细胞质转移到细胞核，进而激活自噬相关基因的转录。然而，高渗应激如何通过钙离子（Ca²⁺）信号通路和TRPML1通道调控TFEB的核转位，仍然是一个有待深入探讨的问题。
论文来源这篇题为《Hyperosmotic Stress Promotes the Nuclear Translocation of TFEB in Tubular Epithelial Cells Depending on Intracellular Ca²⁺ Signals via TRPML Channels》的论文由Takashi Miyano、Atsushi Suzuki、Hisaaki Konta和Naoya Sakamoto共同撰写。他们分别来自东京理科大学（Tokyo University of Science）和东京都立大学（Tokyo Metropolitan University）的机械系统工程研究生院。该论文于2025年1月21日在线发表在《Cellular and Molecular Bioengineering》期刊上，DOI为10.1007/s12195-024-00839-6。
研究流程研究目标本研究旨在阐明高渗应激如何通过TFEB和Ca²⁺信号通路激活自噬，从而揭示细胞对机械应力的反应机制。具体来说，研究团队通过使用甘露醇（mannitol）诱导高渗应激，观察TFEB的核转位现象，并探讨TRPML1通道和钙调磷酸酶（calcineurin）在这一过程中的作用。
实验方法细胞培养与高渗刺激

研究使用NRK-52E大鼠肾小管上皮细胞作为实验对象。细胞在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中培养，并在达到80%融合度时，用含有甘露醇的高渗培养基进行处理。为了研究Ca²⁺信号通路的作用，研究团队使用了细胞内Ca²⁺螯合剂BAPTA-AM和钙调磷酸酶抑制剂FK-506。此外，还使用了TRPML1拮抗剂ML-SI3来评估TRPML1通道的功能。
免疫荧光染色与核转位评估

通过免疫荧光染色观察TFEB的核转位现象。细胞用4%多聚甲醛固定，然后用抗TFEB抗体和Alexa Fluor 488标记的二抗进行染色。细胞核用Hoechst 33342染色。使用ImageJ软件对细胞核和细胞质中的荧光强度进行定量分析，以评估TFEB的核转位程度。
RNA提取与实时定量PCR

从NRK-52E细胞中提取总RNA，并逆转录为cDNA。通过实时定量PCR（RT-qPCR）检测TFEB靶基因（如LC3、VPS18、LAMP1和LAMP2）的表达水平。数据通过2−ΔΔCt方法进行标准化分析。
Western blot分析

通过Western blot分析p70S6K的磷酸化水平，以评估mTORC1的活性。此外，还分析了LC3-II的蛋白水平，作为自噬标志物。细胞核和细胞质部分通过核/质分离试剂盒进行分离，并使用GAPDH和Lamin A/C作为内参。
主要结果甘露醇诱导的高渗应激促进TFEB核转位

实验结果显示，甘露醇处理显著促进了TFEB从细胞质向细胞核的转位，且这一现象在1小时后达到峰值。相比之下，尿素（urea）处理并未显著改变TFEB的核定位，表明TFEB的核转位与细胞收缩引起的机械应力密切相关。
Ca²⁺信号通路调控TFEB核转位

使用BAPTA-AM螯合细胞内Ca²⁺后，TFEB的核转位被完全抑制，而使用EGTA螯合细胞外Ca²⁺则无显著影响。这表明细胞内Ca²⁺在高渗应激诱导的TFEB激活中起关键作用。
钙调磷酸酶在TFEB核转位中的作用

高渗应激显著促进了钙调磷酸酶的活性，并通过其下游转录因子NFAT的核转位得以验证。使用FK-506抑制钙调磷酸酶后，TFEB的核转位被显著抑制，表明钙调磷酸酶在高渗应激诱导的TFEB激活中发挥重要作用。
TRPML1通道在TFEB核转位中的作用

TRPML1拮抗剂ML-SI3显著抑制了高渗应激诱导的TFEB核转位和LC3-II的上调，表明TRPML1通道通过释放Ca²⁺激活钙调磷酸酶，进而促进TFEB的核转位和自噬。
结论本研究表明，甘露醇诱导的高渗应激通过TRPML1通道和钙调磷酸酶激活TFEB，进而促进其核转位和自噬相关基因的表达。这一发现不仅揭示了高渗应激诱导自噬的分子机制，还为理解细胞如何将机械应力转化为生物学反应提供了新的视角。
研究亮点揭示了高渗应激诱导自噬的新机制

本研究首次阐明了TRPML1通道和钙调磷酸酶在高渗应激诱导的TFEB核转位中的关键作用，填补了这一领域的知识空白。
提供了潜在的肾脏疾病治疗靶点

通过调控TFEB和TRPML1通路，可能为治疗与自噬功能紊乱相关的肾脏疾病提供新的治疗策略。
创新性的实验设计

研究团队通过结合免疫荧光染色、Western blot和RT-qPCR等多种技术手段，系统地揭示了高渗应激诱导自噬的分子机制，为相关领域的研究提供了重要的实验参考。
研究意义本研究不仅深化了我们对高渗应激诱导自噬机制的理解，还为开发针对肾脏疾病的新型治疗方法提供了理论依据。此外，研究结果还为探索其他机械应力相关的细胞反应提供了新的研究方向。