间充质干细胞来源的包裹于细胞外囊泡中的TNF-α诱导蛋白6对肾脏的保护作用

一、研究背景与学术意义

急性肾损伤（acute kidney injury, AKI）近年来在全球范围内发病率不断升高，不仅导致肾功能的急性丧失，而且日益被证实与慢性肾病（chronic kidney disease, CKD）的发生、发展密切相关。大量流行病学和基础研究显示，AKI患者中有相当比例最终进展为CKD，形成“AKI向CKD进展”的临床难题。该领域的主要科研问题包括炎症反应、微血管稀疏、缺氧反应、转化生长因子β1（TGF-β1，transforming growth factor β1）信号及上皮-间质转化等，这些过程协同推动肾间质纤维化的发展，而肾间质纤维化则是CKD共同终点。

目前，尚无有效疗法能够阻断或逆转AKI向CKD的进程，因此研发新型干预策略成为肾脏病领域亟需突破的方向。间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）作为具有广谱免疫调节及组织修复功能的多能干细胞，被视为治疗肾脏损伤、减少炎症、抑制纤维化的极具前景的治疗手段。近年研究发现，MSCs的治疗效应主要归因于其分泌的多种活性因子（“secretome”），其中包含溶液中的蛋白、核酸、脂质及以外泌体（extracellular vesicles, EVs）形式包裹的分子。

在已知的多种MSCs分泌因子中，肿瘤坏死因子α诱导蛋白6（tumor necrosis factor-α induced protein 6，TSG-6）被证实具有卓越的抗炎与抗纤维化活性，并在多种组织损伤模型中显示核心作用。但TSG-6是如何由MSCs分泌、其作用机制及如何优化其分泌/携带方式，当前研究仍有重大空白。本项研究紧扣此前沿科学问题，聚焦TSG-6在AKI向CKD转归中的作用，试图破解其作用及分泌机制，并探索增强TSG-6分泌的新策略，为临床转化提供理论及实验依据。

二、论文来源及作者信息

该研究论文题为《Renal protective effects of extracellular vesicle-encapsulated tumor necrosis factor-α-induced protein 6 derived from mesenchymal stem cells》，作者包括Keisuke Morimoto、Ayumu Nakashima、Naoki Ishiuchi、Kisho Miyasako等，主要隶属于Hiroshima University（广岛大学），Twocells Company等机构。论文发表于2025年4月18日，已在期刊《Stem Cells》2025年第43卷第5期以原始研究（Original Research）形式发表（DOI: 10.1093/stmcls/sxaf022）。

三、研究整体设计与实验流程详述（Workflow）

1. 研究总流程概览

本研究以MSCs为起点，通过基因工程与化学处理手段，增强MSCs及其外泌体中TSG-6的表达/封装，并在大鼠急性肾缺血再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury, IRI）模型中，系统评估其抗炎与抗纤维化效应。实验分设体外分子与细胞实验、动物模型干预及机制验证三大板块，穿插流式细胞术、分子生物学、免疫组化等多种实验体系，具有鲜明的层次性与创新性。

2. 具体实验步骤详解

a) TSG-6过表达MSCs的制备

• 对象与方法：采用人源骨髓MSC（由RIKEN BRC提供），在常规培养条件下，以腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）载体转入TSG-6（基因全称：TNFAIP6），形成TSG-6过表达MSCs（TSG-6 MSCs）。对照组MSCs被转入空载AAV（Null MSCs）。
• 新颖点：该部分采用AAV介导MSCs基因工程修饰，避免了部分病毒载体的安全隐患，并根据感染复数（MOI）进行条件优化，确保TSG-6 mRNA稳定高表达。

b) 外泌体与条件培养液制备

• 操作流程：将MSC培养上清液离心（先后300×g、2000×g去除细胞碎片），再经189,600×g超速离心提取外泌体EVs。由TSG-6 MSCs和Null MSCs分别获得TSG-6 MSC-EVs和Null MSC-EVs。同时收集TSG-6 MSCs与Null MSCs的条件培养液（CM）用于后续实验。
• 质量控制：借助流式细胞术和蛋白印迹检测EVs的专属标志（CD9、CD63、CD81），并以纳米粒径分析、透射电镜表征其大小和形态。

c) 动物模型与干预

• 实验对象：选用8周龄雄性Sprague–Dawley（SD）大鼠，行左肾缺血1小时、再灌注构建IRI模型，分组为Sham手术、PBS对照、Null MSC、TSG-6 MSC和I3C MSC（后者为处理组，见下）。
• 干预方式：于再灌注后，经腹主动脉注射5×10^5个MSCs（或PBS）。分别在第7、21天处死动物，获取左肾组织做炎症与纤维化评价。

d) 化学诱导TSG-6高表达

• 方法与创新：筛选吲哚-3-甲醇（indole-3-carbinol, I3C，来源于植物例如西兰花），作为芳香烃受体（aryl hydrocarbon receptor, AHR）激动剂添加至MSC培养基，以激活并提升TSG-6表达。经过剂量梯度优化，最终选定安全、有效的200μM浓度进行细胞处理。

e) 体外功能实验

• 巨噬细胞极化实验：将THP-1单核细胞诱导为巨噬细胞，并分别暴露于不同CM或EVs作用，蛋白印迹或流式检测CD163（M2型标志）和CD11c（M1型标志）。
• 调节性T细胞诱导实验：从人外周血隔离CD4+初始T细胞，经MSC条件液诱导，蛋白印迹检测Foxp3表达判读Treg细胞比例。
• TSG-6敲低实验：以siRNA转染，并联合I3C处理，进一步检验TSG-6表达对MSC功能的关键性。

f) 组织与分子评价

• 免疫组化与纤维化染色：摘取肾组织，制备切片，行α-SMA、Collagen I、CD3、CD68、CD163、Foxp3的免疫组化；以Masson三色染色评定间质纤维化面积。
• 分子检测：实时qPCR、免疫印迹检测TSG-6、TGF-β、α-SMA、Rap1等分子标志。

3. 特色与创新方法

• AAV介导的定向TSG-6过表达MSC稳健且安全
• I3C化学小分子调控MSCs分泌TSG-6，具有实际临床应用推广潜力
• 系统评估MSC外泌体（EVs）为载体的TSG-6作用机制，明晰“EVs-TSG-6-免疫调控”途径
• 涵盖细胞、分子、动物多尺度，机制验证严谨，实验安排逻辑性强

四、主要研究结果详述

1. TSG-6分泌及其载体为外泌体

研究发现，经AAV介导过表达的TSG-6的mRNA在MSC中稳定提高，但细胞内TSG-6蛋白未明显升高，且培养液中游离TSG-6蛋白水平低于ELISA检出限。清晰表明：TSG-6主要被MSC以外泌体方式迅速分泌至胞外，而非储存于胞质。EVs中TSG-6蛋白水平随时间递增，而MSCs内TSG-6含量无显著波动。

2. TSG-6过表达不改变MSC基本特性

流式细胞术及分化能力评估显示，TSG-6过表达不会导致MSC表面表型（CD29/CD44/CD73/CD90等）或成脂、成骨分化能力改变，保证其用于细胞治疗的本质属性保留。

3. TSG-6 MSCs在动物模型中显著抑制肾纤维化

在大鼠肾IRI模型中，注射TSG-6 MSCs较Null MSCs更显著抑制肾组织TGF-β与α-SMA蛋白表达，Masson染色与免疫组化显示纤维化面积、胶原I及α-SMA阳性区比例统计学下降，提示TSG-6可强化MSC抗纤维化效能。

4. TSG-6 MSCs抑制肾炎症细胞浸润，促进免疫调节

炎症相关评价结果发现，TSG-6 MSC组肾脏组织中T淋巴细胞（CD3）、巨噬细胞（CD68）的浸润数量显著减少，而免疫抑制相关的M2型巨噬细胞（CD163）及调节性T细胞（Foxp3）增加。显示TSG-6不仅能抑制炎症，还可正向调节免疫耐受。

5. 验证TSG-6外泌体对免疫细胞的调控

体外实验表明：含TSG-6的EVs可上调巨噬细胞CD163表达，下调M1标志（CD11c），促使巨噬细胞极化为免疫抑制型M2，且去除EVs的条件培养液则失去该效应。此外，TSG-6富集的MSC条件液可强化CD4+ T细胞向Foxp3+ Treg转化，提示TSG-6对免疫微环境重构具关键作用。

6. I3C提升MSC TSG-6表达并增强抗纤维化作用

AHR通路激动剂I3C浓度依赖性地提升MSC TSG-6 mRNA表达，安全剂量下处理的MSC在IRI大鼠模型中同样展现出比未处理MSC更优的抗纤维化、抗炎症作用，包括α-SMA、胶原I表达及组织纤维化面积均显著下降。TSG-6特异敲低显著削弱I3C处理MSC的保护作用，直接验证其功能主导地位。

7. 细胞旁分泌活性与安全性评估

Rap1蛋白在MSC旁分泌功能维持中至关重要，经AAV或I3C处理的MSC，Rap1表达水平均无显著变化，表明基因/药物干预不会损伤MSC固有的治疗活性。

五、结论与深层意义

本研究系统性证明：

1. TSG-6是MSC效应的核心介质，主要以EVs封装形式分泌，直接作用于免疫细胞，抑制炎症、抑制纤维化。
2. 增强TSG-6表达（无论通过基因工程还是I3C小分子诱导）均能有力强化MSC的治疗效能，为促成更为标准化、高效的MSC细胞治疗带来可能。
3. “EVs-TSG-6”轴提供了一种新的疾病调控分子机制，有望成为肾纤维化及免疫相关疾病的新治疗靶点。
4. I3C作为安全的小分子药物，具备低成本、高可及性的应用前景，为MSC临床转化与个体化干预提供新路径。

六、研究亮点与特色

• 明确提出TSG-6封装于EVs为关键作用形式
• AAV及I3C双策略提升MSC治疗效能，方法创新具转化潜力
• 揭示EVs-TSG-6对巨噬细胞极化和Treg诱导的直接调控作用，丰富了免疫调节新机制
• 多尺度、跨学科的实验体系，保证科学理论与可应用价值兼备
• 为标准化、批量生产高效MSC及其EVs奠定理论与技术基础，填补了异质性、批次差异的质量控制空白

七、其他重要信息

• 本文部分成果曾在American Society of Nephrology年会做过报告。
• 研究团队与Twocells Company合作，研究得到日本科研经费资助。
• 补充材料、详细数据可由通讯作者在合理请求下提供。

八、总体评价与展望

该研究不仅在基础机制上阐明了MSC分泌TSG-6并通过EVs封装实现免疫与抗纤维化调控的全新模型，也为临床实际推进MSC/EVs细胞治疗、靶向调控提供了切实可行的策略。通过AAV和I3C双途径优化MSC质量、提升TSG-6含量，更具规范化和大规模生产的前景。这对解决细胞治疗中异质性控制、作用机制明确、应用规范化等难题做出了重要贡献，对肾脏疾病特别是AKI-CKD防治新方案的开发具有里程碑意义和广泛推广应用价值。