PARK7/DJ-1通过分子伴侣介导的自噬和特化SNARE复合体实现非常规分泌的机制研究

神经病学 生物物理学 细胞生物学 生物化学 生命科学 医学 免疫学
非传统分泌 Park7/DJ-1 自噬 SNARE复合体 氧化应激

一、研究背景

帕金森病相关蛋白PARK7/DJ-1（以下简称PARK7）是一种多功能蛋白，在神经退行性疾病、癌症和炎症等多种病理条件下发挥重要作用。尽管缺乏传统的N端信号肽序列，PARK7能在应激条件下被分泌到细胞外，其分泌水平在多种疾病患者的脑脊液和血液中显著升高。然而，PARK7非常规分泌的具体机制长期未明。

先前研究表明，6-羟基多巴胺（6-OHDA）诱导的氧化应激可通过自噬途径促进PARK7分泌，但这一过程中PARK7如何被选择性转运至溶酶体腔，以及分泌性自噬溶酶体如何与质膜融合等关键问题尚未解决。本研究旨在揭示： 1. PARK7在氧化应激条件下通过分子伴侣介导的自噬（CMA, chaperone-mediated autophagy）途径转运至溶酶体的分子机制 2. 介导PARK7分泌的特化SNARE（可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体）复合体的组成和功能

二、论文来源

本论文由日本同志社大学生命医学研究科的Biplab Kumar Dash、Yasuomi Urano（通讯作者）等团队完成，发表于《美国国家科学院院刊》（PNAS）2025年122卷19期，DOI:10.1073/pnas.2414790122。

三、研究流程与结果

1. 6-OHDA诱导PARK7非常规分泌的验证

实验设计： - 使用HeLa细胞系，通过不同浓度6-OHDA处理 - 采用无血清培养基培养后收集条件培养基 - 三氯乙酸沉淀法富集分泌蛋白，Western blot检测PARK7分泌水平

关键发现： - 6-OHDA剂量依赖性增加PARK7分泌（Fig.1B） - 布雷菲德菌素A（BFA）阻断ER-高尔基体途径不影响PARK7分泌（Fig.1D） - 超速离心分离外泌体显示PARK7仅存在于可溶组分（补充图S1A） - GW4869抑制外泌体释放不影响PARK7分泌（补充图S1B）

结论：6-OHDA诱导的PARK7分泌不依赖经典分泌途径和外泌体释放。

2. 自噬通量在PARK7分泌中的作用

创新方法： - 串联荧光标记LC3（tfLC3）报告系统：利用GFP（酸敏感）和mRFP（酸稳定）区分自噬体（黄色斑点）和自噬溶酶体（红色斑点）

关键实验： - 6-OHDA处理增加LC3-II转化和SQSTM1/p62降解（Fig.2A） - 巴弗洛霉素A1（BafA1）和氯喹（CQ）处理进一步增加LC3-II积累（Fig.2B） - tfLC3显示6-OHDA同时增加自噬体和自噬溶酶体数量（Fig.2C）

机制验证： - ULK1抑制剂MRT68921和FIP200敲除细胞抑制PARK7分泌（Fig.3A-C） - 雷帕霉素诱导自噬可增强PARK7分泌（Fig.3D） - 抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）抑制6-OHDA诱导的分泌（Fig.3E-F）

3. 溶酶体功能的关键作用

技术突破： - 亚细胞分级分离结合溶酶体标志物LAMP1检测（Fig.4C） - 免疫荧光共定位分析PARK7与LAMP2

重要发现： - 溶酶体抑制剂（CQ+NH4Cl）导致细胞内PARK7积累（Fig.4A） - STX17（自噬体-溶酶体融合必需蛋白）敲除显著抑制分泌（Fig.4D-E） - 但SNARE伴侣蛋白SNAP29/47敲除不影响分泌（Fig.5）

4. 特化SNARE复合体的鉴定

方法创新： - AlphaFold2 multimer预测蛋白质复合体结构（补充图S5F-G） - 免疫共沉淀验证SNARE相互作用（Fig.7G）

关键结果： - Sec22b（R-SNARE）敲除抑制分泌（Fig.7B） - STX3/4（质膜Qa-SNARE）双敲除完全阻断分泌（Fig.7C） - Vti1b（Qb-SNARE）和STX8（Qc-SNARE）敲除显著抑制分泌（Fig.7E-F） - 6-OHDA促进SNARE复合体形成（Fig.7G）

5. CMA介导的PARK7转运机制

创新发现： - PARK7含4个保守的KFERQ样基序（补充图S6D） - 位点定向突变显示91/92、94/95和44/45位点对分泌关键（Fig.8B-C） - Hspa8和LAMP2敲除抑制分泌（Fig.8D） - 交联实验显示分泌型PARK7主要为单体（Fig.8F）

四、研究结论与意义

本研究首次阐明： 1. 分子机制：6-OHDA通过氧化应激诱导PARK7单体化，暴露KFERQ样基序，经Hspa8-LAMP2的CMA途径转运至溶酶体腔 2. 分泌途径：特化SNARE复合体（STX3/4-Vti1b-STX8-Sec22b）介导分泌性自噬溶酶体与质膜融合 3. 概念创新：提出”分泌性自噬溶酶体介导的分泌”新范式

科学价值： - 为神经退行性疾病中异常蛋白分泌提供机制解释 - 揭示CMA在蛋白质分泌中的新功能 - 为靶向调控PARK7分泌的治疗策略提供分子靶点

五、研究亮点

  1. 方法创新：整合tfLC3活细胞成像、AlphaFold2结构预测和交联质谱技术
  2. 机制突破：首次将CMA途径与SNARE介导的膜融合机制关联
  3. 临床意义：为帕金森病等神经退行性疾病的生物标志物开发和治疗提供新思路

六、其他发现

  • TMED10敲除意外增加PARK7分泌（Fig.8A），提示存在未知调控途径
  • 溶酶体膜通透性（LMP）检测显示6-OHDA不破坏溶酶体完整性（Fig.6）
  • 蛋白酶体抑制不影响PARK7分泌（补充图S4），证实途径特异性