利用标记性染色体的差异消除实现单株系非转基因雄性蚊子的生产

传染病学 生物工程 遗传学 生命科学 医学
蚊子控制 性别分离 同型性染色体 隐性致死 昆虫不育技术

研究背景

埃及伊蚊（*Aedes aegypti*）是登革热、寨卡病毒等虫媒病毒的主要传播媒介。当前基于释放不叮咬雄蚊的遗传控制策略（如不育昆虫技术SIT或沃尔巴克氏体不相容技术IIT）面临核心瓶颈：如何高效、低成本地分离数百万只不含叮咬雌蚊污染的雄性个体。传统方法依赖形态学筛选或转基因标记，但存在效率低、成本高或监管障碍等问题。本研究针对这一难题，利用埃及伊蚊同形性染色体（homomorphic sex chromosomes）的特性，开发了名为”差异消除标记性染色体”（DEMARK）的创新技术体系。

埃及伊蚊的性别决定由1号染色体上的M/m位点控制：M染色体携带雄性决定基因（如*nix*和*myo-sex*），但与m染色体在形态上高度相似。前期研究发现，M/m染色体周围存在约100 Mb的低重组区域（recombination desert），这为开发基于性别连锁隐性致死等位基因（recessive lethal alleles, RLAs）的性别分离策略提供了理论基础。

论文来源

本论文由Virginia Tech的Zhijian Tu团队领衔，联合University of California, Riverside等机构合作完成，于2025年5月8日发表在《PNAS》（Proceedings of the National Academy of Sciences）期刊，标题为《Differential elimination of marked sex chromosomes enables production of nontransgenic male mosquitoes in a single strain》。

研究流程与结果

1. 性别染色体重组率精确测量

实验设计：
- 使用三个转基因标记系（C1-dsRed：167.945 Mb；P14-GFP：180.261 Mb；P10-GFP：224.678 Mb）
- 通过大规模后代筛选（>10,000只幼虫）计算标记与M位点的遗传距离

关键发现：
- C1与M位点重组率仅0.043%（16 Mb物理距离对应0.043 cM）
- P14与M位点重组率0.079%（28 Mb对应0.079 cM）
- 证实该区域存在极端重组抑制现象（比果蝇低1000倍）

技术亮点：
采用牛津纳米孔测序（Oxford Nanopore sequencing）精确定位转基因插入位点（Dataset S2），开发高分辨率遗传图谱构建方法。

2. 天然性别连锁隐性致死等位基因（RLAs）的发现与验证

实验流程：
1. 通过C1标记系自然重组获得重组染色体：
- mᶜ¹ᵃ（获得C1标记和致死等位基因*l*）
- m¹（丢失*l*的m染色体）
2. 设计互补实验验证致死效应：
- mᶜ¹ᵃ/mᶜ¹ᵃ雌性胚胎致死
- mᶜ¹ᵃ/M雄性胚胎致死（可被m¹拯救）

数据支撑：
- 杂交实验显示雌雄比例显著偏离1:1（SI附录Table S5）
- 数字液滴PCR（ddPCR）证实*l*的隐性致死特性

3. DEMARK技术体系开发

(1) 双标记染色体差异消除（DE2mark）

系统设计：
- 使用携带相同*l*但不同荧光标记的染色体（mᶜ¹ᵃ-dsRed与mᴾ¹⁴ᵈ-GFP）
- 自维持循环：
mᴾ¹⁴ᵈ雌 × mᶜ¹ᵃ雄 → 非转基因雄（m¹/m） + 标记雌/雄
- 双标记雌性（mᶜ¹ᵃ/mᴾ¹⁴ᵈ）因*l*纯合致死

实验结果：
- 13,186只个体中仅1例双阳性重组雌性（SI附录Table S7）
- 非转基因雄性产出效率达34.5%（4,544⁄13,186）

(2) 单标记染色体差异消除（DE1mark）

工程化RLAs开发：
- CRISPR/Cas9敲除必需但单倍剂量充足基因：
- *amon*（神经内分泌转化酶基因，距M位点 Mb）
- *bag*（同源盒基因，距P14标记260 kb）

系统性能：
- DE1mark_bag：仅产生非转基因雄（m/mᵇᵃᵍ⁻）和转基因雌（mᴾ¹⁴ᵈ/mᵇᵃᵍ⁻）
- 交配竞争力实验显示：DE1mark雄与野生型无显著差异（GLMM分析p=0.493）

研究结论与价值

  1. 科学价值：

    • 首次利用同形性染色体的特性实现自维持性别分离系统
    • 揭示埃及伊蚊性别染色体演化新机制（proto-Y/X假说）

  2. 应用价值：

    • 单品系即可规模化生产非转基因雄蚊（降低成本50%以上）
    • 兼容现有SIT/IIT技术体系，规避转基因生物监管障碍

  3. 技术扩展性：

    • 提出适用于按蚊（*Anopheles*）异形性染色体的DEMARK改良方案（图6b）
    • 可整合条件致死系统实现无筛选生产

研究亮点

  • 方法创新性：将”平衡染色体”概念创新应用于媒介控制
  • 技术突破：实现0.001%级别的性别分离纯度
  • 跨物种潜力：为其他害虫遗传防控提供普适性框架