用于连续左旋多巴监测的工程化直接电子转移酶的开发与应用

开发用于持续监测左旋多巴的工程化直接电子转移酶

背景介绍

帕金森病(Parkinson’s Disease, PD)是一种影响全球数百万人的慢性神经退行性疾病,其主要特征是黑质多巴胺能神经元的丢失以及α-突触核蛋白聚集成路易体颗粒(Lewy bodies)分布于神经元中。尽管左旋多巴(levodopa)是PD治疗的主要药物,能够有效缓解运动症状,但由于其治疗窗口非常狭窄,给药不当可能导致严重的副作用,如恶心、运动障碍或症状的反弹。这一问题加剧了对实时左旋多巴监测手段的需求。然而,当前缺乏能够实现连续左旋多巴监测的设备,主要原因在于现存技术无法做到对左旋多巴的高灵敏度和高特异性检测。

与糖尿病管理中普遍使用的连续血糖监测设备(CGM)不同,PD管理中的持续左旋多巴监测系统仍未实现。本文的作者指出,开发一种持续监测左旋多巴的设备不仅能帮助优化PD患者的用药剂量,还可以显著提高对左旋多巴药代动力学的理解,进而提升疾病管理的效果。文中介绍的研究旨在开发一种创新的连续左旋多巴传感器,以解决当前技术手段的不足。

论文来源

本文发表在《npj biosensing》期刊中,文章题目为“the development and application of an engineered direct electron transfer enzyme for continuous levodopa monitoring”。该研究由Kartheek Batchu, David Probst, Takenori Satomura, John Younce和Koji Sode等人共同完成,分别来自美国北卡罗来纳大学教堂山分校-北卡罗来纳州立大学联合生物医学工程系、佛蒙特大学医学学院、福井大学工学部以及北卡罗来纳大学神经病学系。论文于2025年正式发表。

研究设计与实验流程

1. 本研究总体设计

为了实现持续左旋多巴监测,研究团队发展了一种基于直接电子转移(Direct Electron Transfer, DET)机制的工程化酶铜脱氢酶(CODH, Copper Dehydrogenase)。这一酶来源于一种极端嗜热古菌(hyperthermophilic archaeon)中的多铜氧化酶(Multicopper Oxidase, MCO)。通过定向突变技术,作者对酶的2型和3型铜配位组组(Type 2 & Type 3 Copper Ligand)环节进行了改造,大幅降低了其氧化酶活性,同时提高了其与电极表面的直接电子传递能力。

2. 方法与实验细节

a) 酶的工程化改造

研究团队首先在多铜氧化酶(MCO)模型基础上进行了酶的突变与构建。通过在编码酶His396和His459位点引入突变(如H396A/H459A),酶的氧化还原机制发生了显著变化。突变版本的MCO即被命名为“铜脱氢酶”(CODH)。通过定向进化,去除2型以及3型铜离子位点的同时,保留1型铜离子(T1 Copper)作为与电极直接电子转移的位点,而非传统的氧还原终端受体。

作者采用UV-Vis吸收光谱确认T1中心保存完好,并排除了T2/T3铜离子活性。此外,突变后的CODH通过丙二酰亚胺二硫长链DSH-SAM(Self-assembled Monolayer,自组装单分子层)固定在金电极表面,以优化精确度。

b) 酶活性与稳定性验证

工程化酶的氧化酶活性通过ABTS底物的氧化能力测定,相较原始MCO,氧化酶活性被减少至1.5%以下。进一步的直接电子转移实验表明,在去除了氧气的条件下,工程CODH与金电极的催化电流保持稳定,与360 µm左旋多巴浓度对应的信号峰值仅下降21%。

c) 酶电化学传感器构建

通过使用一个三电极系统构建了最初的原型传感器:金盘电极(Gold Disc Electrode, GDE)作为工作电极,银/氯化银参比电极和铂对电极。随后,研究小组将传感器进一步微型化,使用直径为76.2 µm的金微丝作为工作电极,并采用两电极系统代替三电极系统以优化适配皮下插入式应用。

d) 样品测试与传感器性能评估

在浓度范围为0–55 µm的左旋多巴溶液中进行了电化学测定。微型化左旋多巴传感器在100 mM磷酸缓冲液(pH 7.0)中表现出了LOD(检测限)为138 nm,灵敏度为0.0042 µa/µm的优异性能。此外,为模拟体内环境的检测,评估了干扰物(如多巴胺、羟基苯乙醇等)的影响,结果显示除甲基多巴(3-o-Methyldopa)略高于10%的信号偏离外,其它背景信号的偏离均低于10%。

3. 环境因素影响与长期存储性能

研究进一步表明,传感器在pH范围6-8和室温至体温(25°C至37°C)的条件下,电化学信号变化微乎其微。此外,传感器可在4°C条件下储存21天,同时灵敏度维持在初始值的95%以上。

4. 临床意义和下一步实验计划

研究团队计划结合临床PD患者的皮下传感器应用,进一步开发兼容生物相容性的层结构及抗体环境抗扰算法,以提高传感器在活体中的稳定性和实用性。未来目标包括将此技术与现有的左旋多巴持续输注系统结合,实现PD患者的闭环(Closed-loop)治疗系统。

研究意义与亮点

本文是首次公开开发不依赖氧终端电子受体的DET型多铜氧化酶的研究,也是首次基于此类酶构建左旋多巴传感器的工作。本研究的几个显著亮点包括:

  1. 特异性高的左旋多巴检测:通过工程化突变得到的CODH展示了极高的左旋多巴特异性,相较传统使用酪氨酸酶和直接氧化的传感器大幅减少了干扰物的信号偏离。

  2. 创新的直接电子转移机制:去除氧化酶氧还原半反应后的T1-COPPER部位,仅与金电极直接作用,独立于溶解氧浓度变化的影响。

  3. 微型化设计及抗干扰测试:传感器实现了微型化设计,并以18种干扰物作为基准延展干扰评估,在更加接近临床环境的检测中证明了其实用性。

  4. 适合连续监测的长期稳定性:传感器在实验室条件下储存稳定达3周,并且具有高灵敏性和低检测限,为实时药物剂量检测与优化提供潜力。

总结

本研究通过开发一种革命性的DET型酶-铜脱氢酶(CODH),提出了用来实现实时左旋多巴监测的全新电化学方法,并深入证明了其高稳定性和特异性。这一创新性的研究不仅为PD患者的个性化治疗提供了科学基础,同时也为其他连续药物监测系统的设计和开发奠定了技术框架。随着进一步的研究和临床测试,本文所描述的技术有望成为PD治疗模式的一次重要突破,为患者带来更高的生活质量。