GLP-1R激动剂通过激活AMPK减轻转基因小鼠的阿尔茨海默相关表型

2025-06-28 Sat
GLP-1R激动剂 AMPK 阿尔茨海默病转基因小鼠神经保护淀粉样蛋白负荷糖尿病
一、研究背景与科学问题阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）是全球最常见的神经退行性疾病，其病理特征主要包括神经元损失、神经纤维缠结和老年斑（主要由淀粉样β蛋白[amyloid-β, Aβ]沉积形成）。据统计，AD患者人数逐年攀升，严重威胁老年群体的生活质量，也给社会和医疗体系带来了极大负担。
与此同时，流行病学研究发现2型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus, T2DM）患者发生AD的风险明显增加。脑内葡萄糖稳态的紊乱、胰岛素抵抗与AD的发病关系密切。越来越多证据表明，葡萄糖代谢异常、能量代谢障碍以及胰岛素信号损伤可作为AD早期诊断的重要生物标志物，有潜力在疾病的早期干预和防治中发挥作用。
基于糖尿病管理的药物开发，胰高血糖素样肽1受体激动剂（glucagon-like peptide-1 receptor agonists, GLP-1RAs）已被广泛用于T2DM的血糖控制。不仅如此，越来越多临床队列和基础研究指出，GLP-1RAs具有神经保护作用，在AD及其他神经退行性疾病中展现出广阔的治疗前景。然而，GLP-1RAs对AD病理学作用机制尚不充分明了，特别是其在脑能量代谢、Aβ生成和神经炎症等方面的影响机制，亟需系统研究。
在这一领域背景下，本篇论文针对GLP-1R激动剂在阿尔茨海默病发病机制中的作用进行了系统探索，试图阐释其分子机制，并为AD的预防与治疗提出新的思路。
二、论文来源与基本信息该论文题为“activation of ampk by glp-1r agonists mitigates alzheimer-related phenotypes in transgenic mice”，由Yun Zhang、Huaqiu Chen、Yijia Feng等多位学者联合完成，主要作者来自温州医科大学、大连医科大学、香港大学等国内外知名高校与医学研究机构。文章于2025年6月发表在国际知名期刊“nature aging”（Nature Aging）第5卷1097-1113页。
三、研究设计与具体流程本研究为单一原创性基础医学实验，结合人群数据、动物模型、细胞实验及分子机制等多维度，系统阐释GLP-1R激动剂通过AMPK通路对AD多重病理表型的调控机制。具体流程如下：
1. 人群与模型动物的GLP-1水平及AD病理相关性分析对象与方法：收集AD模型小鼠（app23/ps45双转基因小鼠）与野生型（WT）对照小鼠外周血浆样本（每组各12只，公母各半），测定GLP-1水平。同时，从12例经严格筛选（剔除糖尿病等影响因素）的AD患者中采集血浆，使用18F-AV45 PET成像评估脑内Aβ沉积负荷，相关性分析GLP-1水平与脑内Aβ病理的关系。
实验技术：酶联免疫吸附法（ELISA）测定GLP-1水平均，PET/MR结合定量分析脑区域Aβ斑块负荷。
2. GLP-1RA对AD模型小鼠神经元与星形胶质细胞能量代谢的影响对象与方法：分离AD模型与WT小鼠胚胎期（E17）原代神经元和星形胶质细胞，研究GLP-1RA（Exendin-4）对其葡萄糖摄取、ATP生成、脂肪酸氧化（FAO）、氧化磷酸化（Oxphos）等代谢活动的调控。
技术亮点：采用Seahorse XF96细胞线粒体压力测试评估细胞氧耗率（OCR）、ATP合成能力。利用免疫荧光检测神经元胞膜葡萄糖转运蛋白GLUT3分布，结合代谢产物（例如丙酮酸、活性氧[ROS]）分析细胞代谢状态。
3. AMPK信号通路的分子机制探讨对象与方法：针对AMP激酶（AMPK）信号，分别借助药物激活剂（AICAR）与抑制剂（Compound C）以及基因编辑（shRNA干扰GLP-1R、AMPK），验证GLP-1RA作用下AMPK活化途径及其依赖性。
机制挖掘：考察Ca2+/CaM依赖性蛋白激酶激酶2（CaMKK2）以及肝激酶B1（LKB1）在AMPK磷酸化过程中的作用，并通过钙离子荧光探针（Fluo-4 AM）测定细胞Ca2+水平，STO609抑制剂阻断验证机制。
4. GLP-1RA影响APP分解及Aβ生成的机制研究模型与操作：在原代神经元与APP人源突变稳定表达细胞（20E2细胞系）中，经GLP-1RA处理，监测β位点APP裂解酶1（BACE1）表达，APP裂解产物（C99、C89）、Aβ40/Aβ42分泌水平，并以AMPK抑制剂、AMPK基因敲降分别佐证药物效应的分子依赖性。
5. AMPK/NF-κB对BACE1转录调控机制技术流程：构建人源BACE1启动子（-1942至+292 bp）连接荧光素酶（Luc）报告基因，通过N2A细胞转染并药物干预，定量启动子活性变化。同时结合qPCR、WB检测内源性BACE1表达变化。
分子机制：细胞亚细胞组分分离及染色质免疫沉淀（ChIP）实验明确NF-κB p65在AMPK抑制与激活条件下对BACE1启动子的结合能力，完整连通AMPK→NF-κB→BACE1转录调控路径。
6. GLP-1RA对小胶质细胞吞噬与炎症的影响细胞实验：鼠源BV2小胶质细胞处理GLP-1RA，并联合Aβ寡聚体刺激，评估AMPK磷酸化及RNA测序分析差异表达基因（DEGs）。
功能检测：归纳RNA-Seq分析结果，运用GO/KEGG富集分析比对GLP-1RA调控信号通路变化。结合免疫荧光与WB检测CD68和LAMP1（吞噬与溶酶体标志物）表达，荧光标记Aβ42吞噬功能评估，炎症因子产物水平（ELISA）测定药物效应。
7. GLP-1RA在AD模型小鼠体内干预实验动物给药与检测：app23/ps45 AD模型小鼠6周龄起每日腹腔注射Exendin-4（25 nmol/kg）持续8周，对照组给予溶媒。实验结束后，分区取样，分析脑内AMPK活化、APP裂解、Aβ产生、BACE1表达及神经炎症水平。
病理与行为学检测：采用4G8抗体及Thioflavin S染色检测脑神经元淀粉样斑块量化，Morris水迷宫测试评估认知功能恢复情况。
四、关键研究发现与结果链条1. GLP-1水平与AD病理紧密相关血浆GLP-1水平在AD模型小鼠显著降低，低GLP-1与患者海马区Aβ负荷高度负相关（r = -0.825），提示GLP-1下降是AD能量代谢和淀粉样负荷紊乱的重要特征。AD模型神经元同时伴随葡萄糖摄取及ATP合成障碍，表明脑能量代谢障碍与GLP-1密切相关。
2. GLP-1RA恢复能量代谢并调节细胞代谢活动GLP-1RA（Exendin-4）处理显著提升AD神经元葡萄糖摄取和ATP生成能力，增强星形胶质细胞的FAO和Oxphos功能。免疫检测进一步显示GLUT3表达及膜转位提升，PGC-1α（线粒体生物发生调控因子）水平提高，增强神经元能量供给。代谢产物检测发现药物可显著抑制AD相关ROS异常升高，抑制氧化应激损伤。
3. CaMKK2-AMPK信号通路为药物效应核心体外细胞实验证明，Exendin-4和Tirzepatide（双重GIP/GLP-1RA）剂量依赖性增强AMPK及下游ACC磷酸化活性，该效应依赖GLP-1R表达。磷酸化增加主要通过Ca2+信号刺激CaMKK2介导，LKB1途径无显著变化。STO609阻断试验证实了CaMKK2对该信号轴的枢纽作用。
4. GLP-1RA通过AMPK抑制BACE1表达，减少Aβ生成药物处理背景下，BACE1蛋白和活性被显著下调（神经元至53.6%，细胞系至39.8%），下游APP裂解产物与Aβ40/42水平均明显下降。AMPK抑制剂及基因敲降均能削弱甚至消除药物效应，证明AMPK为核心信号枢纽。
5. NF-κB介导AMPK对BACE1基因表达的转录调控利用Luc报告基因和ChIP实验，证实AMPK活性直接影响BACE1启动子活性，AMPK激活下BACE1转录下调，激活剂AICAR显著降低细胞核与胞质NF-κB p65水平，AMPK抑制则增强NF-κB与BACE1启动子结合强化表达。揭示AMPK/NF-κB/BACE1为GLP-1RA调控AD发生的分子通路。
6. GLP-1RA激活AMPK促进小胶质细胞吞噬Aβ，缓解神经炎症RNA-seq联合GO/KEGG分析揭示GLP-1RA改善代谢相关基因表达模式，强化吞噬、葡萄糖转运和能量代谢通路，抑制炎症反应相关信号。免疫检测证实CD68、LAMP1上调，吞噬荧光Aβ能力增强，神经炎症因子（IL-1β、IL-6、TNF）水平下调，抗炎因子（TGF-β）升高。AMPK信号阻断可逆转这一药效。
7. 体内干预动物模型验证GLP-1RA多维疗效AD模型小鼠经Exendin-4长期干预后，脑内AMPK磷酸化水平提高，BACE1及Aβ生成显著降低，APP整体蛋白水平无变化。病理检测斑块数量约减少一半，炎症反应（IL-1β、IL-6、TNF下降）明显缓解，认知行为（Morris水迷宫逃脱潜伏期及空间记忆指标）获得实质性改善。
五、结论与意义本研究系统证明GLP-1RA通过CaMKK2-AMPK信号轴活化，恢复脑细胞能量代谢、抑制Aβ生成和沉积、改善神经炎症和促进Aβ清除，从而全面逆转AD模型动物的核心病理和行为异常。AMPK信号通路是GLP-1RA多途径整合效应的枢纽靶点。研究不仅进一步丰富了AD发生发展的分子机制图谱，也首次提出GLP-1RA/AMPK/NF-κB/BACE1信号新轴，有望为未来AD“代谢激活”类干预开辟新方向。
该研究具有双重科学及临床应用价值：一方面丰富了脑能量代谢与AD病理交互调控网络，为药物筛选和靶点开发提供了理论依据；另一方面，作为临床T2DM和肥胖管理主流用药，GLP-1RA的安全性和可及性使其转化为AD防治药物具有现实基础，相关临床试验值得加速推进。
六、研究亮点与创新点首次明确了外周GLP-1下降是AD脑能量代谢障碍和Aβ沉积的重要表征。
揭示GLP-1RA作用通过CaMKK2-AMPK激活，对葡萄糖、脂肪酸代谢、APP裂解过程及神经炎症等实现多环节调控。
分子机制创新性阐明AMPK经NF-κB对BACE1的转录调控路径，实现对Aβ生成的直接抑制。
多模型、多尺度（人-动物-细胞）多技术平台耦合设计，研究逻辑严谨，数据链路完整。
为“代谢优化—神经保护”理念下的AD防治药物开发提供了新范式和实证基础。
七、其他值得关注的内容研究重视性别变量，实验在雌雄动物及患者中均获得一致性结果，体现科学严谨性。
详细阐述了所用细胞与动物模型来源、药物剂量、数据统计学方法，为后续同行重复和机制深入研究打下基础。
多组实验均辅以多重重复验证和定量统计，保证结果的可靠性和科学性。
八、总结与展望这是一项兼具理论创新与应用前瞻性的基础研究，全面系统地阐述了GLP-1R激动剂通过AMPK通路改善AD能量代谢障碍、病理蛋白沉积、炎症反应及认知损伤的整体链条。为探索和发展AD等神经退行性疾病的新型代谢调控治疗策略提供了坚实基础。随着相关机制补充和临床研究的进一步深入，GLP-1RA或AMPK为核心的代谢调节药物策略有望成为AD治疗领域的重要新突破。