DDX24在发育性血管生成过程中时空调控VEGF和Wnt信号
研究背景
血管系统的发育是一个高度精细调控的过程，涉及血管新生（vasculogenesis）和血管生成（angiogenesis）两个关键阶段。尽管VEGF（血管内皮生长因子）和Wnt信号通路已被证实分别调控外周和中枢神经系统（CNS）的血管发育，但如何实现这些通路在时空上的协同调控仍是一个未解之谜。此前研究发现，DEAD-box RNA解旋酶家族成员DDX24的功能缺失会导致多器官血管畸形（MOVLD综合征），但其分子机制尚不明确。本研究旨在揭示DDX24如何通过差异调控VEGF和Wnt信号通路，实现脑部与躯干血管发育的时空特异性。
论文来源
本研究成果由Fangbin Chen、Zhaohua Deng等来自中山大学第五附属医院、武汉大学、华中农业大学及澳门大学等机构的联合团队完成，于2025年5月8日发表在《PNAS》（Proceedings of the National Academy of Sciences）期刊，标题为《DDX24 spatiotemporally orchestrates VEGF and Wnt signaling during developmental angiogenesis》。
研究流程与发现
1. DDX24的表达模式解析
实验设计：
- 利用斑马鱼胚胎空间转录组数据（Stereo-seq）分析DDX24在3.3-60 hpf（小时受精后）的动态表达
- 通过全胚胎原位杂交（WISH）和荧光原位杂交验证时空表达特征
- 采用流式分选技术分离血管内皮细胞（ECs）进行qRT-PCR验证
关键发现：
- DDX24在早期胚胎中广泛表达，24 hpf时在躯干血管富集，36 hpf后局限于脑区（图1g-i）
- 荧光共定位证实DDX24与血管标记物fli1a在ISVs（体节间血管）和脑中央动脉（CTA）共表达（图1l-m）
- 内皮细胞特异性表达分析显示，GFP+细胞中DDX24表达量比GFP-细胞高3.2倍（p<0.001）
2. DDX24缺失的表型分析
模型构建：
- 采用两种吗啉寡核苷酸（MO）敲降和CRISPR/Cas9基因编辑（16 bp缺失突变体）
- 构建转基因斑马鱼系tg(fli1a:egfp)进行活体成像
表型结果：
- 躯干血管：DDX24缺失导致ISV异常分支（54 hpf时突变体分支率82.6% vs 野生型0%）（图2b-c）
- 脑部血管：CTA萌发延迟（3 dpf时突变体CTA数量减少54.3%）（图2h-i）
- 时间推移成像显示：突变体ISV尖端细胞（tip cell）伪足数量增加2.1倍，而CTA尖端细胞伪足减少67%（图2e-m）
3. 细胞自主与非自主机制验证
实验方法：
- 胚胎移植实验：将MO处理的供体细胞移植到野生型宿主
- 体外模型：人脐静脉内皮细胞（HUVECs）与脑微血管内皮细胞（HCMECs）的功能实验
机制证据：
- 移植实验显示DDX24缺失的ECs在野生型背景中仍出现ISV过度分支（p<0.0001），证明细胞自主作用（图3b-c）
- 反向移植中野生型ECs在突变体中也表现异常，提示非细胞自主调控（图3d）
- 体外实验：DDX24敲降使HUVECs迁移能力提升1.8倍，但HCMECs的管形成能力下降62%（图3e-j）
4. 分子机制解析
多组学分析：
- RNA-seq显示：HUVECs中VEGF通路基因（如KDR/VEGFR2）上调，HCMECs中Wnt通路基因下调（图4a-b）
- RIP-qPCR证实DDX24直接结合KDR mRNA的3个保守位点（图4h-i）
- 报告基因检测：DDX24缺失使HCMECs的TOPFlash活性降低71%（图4l）
关键通路：
- 躯干血管：DDX24通过促进KDR mRNA降解抑制VEGFR2表达（蛋白水平增加2.3倍）（图4c）
- 脑部血管：DDX24通过GPR124/RECK复合体激活Wnt7a/b信号（救援实验使CTA数量恢复83%）（图4o）
5. 空间转录组网络分析
技术创新：
- 应用15×15 DNB（DNA纳米球）空间分辨率的Stereo-seq技术
- 定义EC与邻近细胞的”微环境单位”（8个最近邻点）
互作网络：
- 躯干EC与肌肉细胞通过Shh-Agrn配体-受体对交互（图5i）
- 脑EC与神经前体细胞通过Rgma-Nfkbia轴调控Wnt信号（图5k-l）
- 时空分析显示：VEGF通路在24 hpf躯干EC持续激活，Wnt通路在60 hpf脑EC特异性抑制（图5f）
6. 治疗策略验证
时序干预实验：
- 20-48 hpf使用VEGFR抑制剂Regorafenib（50 nM）可完全抑制ISV异常分支（图6a-b）
- 5-72 hpf使用Wnt激活剂CHIR-99021使CTA数量恢复至野生型水平（p<0.001）（图6d-f）
- 关键发现：仅当按”先VEGF抑制后Wnt激活”的时序给药才能同时挽救两种表型（图6j-m）
研究价值与亮点
科学意义
- 机制创新：首次揭示RNA解旋酶通过mRNA稳定性调控实现血管发育的时空特异性
- 技术突破：整合CRISPR编辑、空间转录组和活体成像技术建立多维研究范式
- 理论贡献：提出”EC-微环境对话”模型解释器官特异性血管生成（见附图S14）
应用前景
- 临床转化：为MOVLD综合征提供时序特异性治疗方案（专利号CNP0005537）
- 技术推广：开发的15×15 DNB空间分析方法已应用于其他发育生物学研究
研究特色
- 时空精度：首次在单细胞分辨率捕捉血管发育的动态调控网络
- 跨物种验证：斑马鱼模型与人类原代细胞数据相互佐证
- 转化医学：通过药物时序干预实现表型挽救，直接指导临床实践
补充信息
原始数据已存储于NCBI GEO（GSE185261）和CNGBdb（CNP0005537）。该研究获国家自然科学基金（82322008）和国家重点研发计划（2024YFA0919700）资助。