Les luciférases de novo permettent une imagerie bioluminescente multiplexée

Contexte académique

La bioluminescence est une technologie d’imagerie hautement sensible et non invasive qui permet le suivi en temps réel dans des organismes vivants, sans avoir recours à une source lumineuse externe. Les luciférases, enzymes clés catalysant la réaction lumineuse, présentent cependant de nombreuses limitations à l’état naturel, telles qu’un mauvais repliement protéique, une grande taille, une dépendance à l’ATP, et une faible efficacité catalytique. Ces contraintes freinent l’application large de la bioluminescence dans la recherche biomédicale. Ces dernières années, bien que certains progrès aient été faits par ingénierie dirigée (directed evolution) sur les luciférases naturelles, ces techniques n’ont pas permis de surmonter totalement ces obstacles.

Pour résoudre ces problèmes, l’équipe de recherche a mis à profit des méthodes de design protéique fondées sur l’apprentissage profond afin de concevoir de novo une nouvelle famille de luciférases, baptisée NeoLux. Ces luciférases artificielles possèdent à la fois une excellente efficacité catalytique, une stabilité accrue, un petit volume, une indépendance vis-à-vis de l’ATP, mais peuvent aussi être fusionnées à des protéines fluorescentes (fluorescent protein, FP) pour former des systèmes hautement efficaces de transfert d’énergie par résonance de fluorescence (FRET), permettant une imagerie bioluminescente multiplexée. Ce travail ouvre de nouvelles perspectives pour l’application de la bioluminescence.

Source de la publication

Cette étude a été réalisée par Julie Yi-Hsuan Chen, Qing Shi, Xue Peng et leurs collègues de l’Université de Californie à Santa Cruz, sous la direction d’Andy Hsien-Wei Yeh (auteur correspondant). L’article est publié le 13 mars 2025 dans la revue Chem, sous le titre « De Novo Luciferases Enable Multiplexed Bioluminescence Imaging ».

Processus de recherche et résultats

1. Conception computationnelle et validation expérimentale de luciférases de seconde génération

Les chercheurs ont d’abord utilisé le modèle d’intelligence artificielle ProteinMPNN pour explorer l’espace de séquences de la première génération de luciférase, LuxSit-I, générant 10 000 nouvelles séquences d’acides aminés. Après prédiction des structures protéiques correspondantes par AlphaFold2, 191 séquences candidates ont été sélectionnées pour validation expérimentale. Parmi elles, 134 montraient une activité luciférase, montrant que la structure et la fonction pouvaient être maintenues. Les vingt meilleures ont été produites et purifiées à grande échelle, permettant d’obtenir 16 protéines monomériques actives.

Pour améliorer davantage l’activité luciférase, l’équipe a combiné par mutations ciblées diverses substitutions au niveau de la poche catalytique de NeoLux1, obtenant NeoLux1.2, dont l’activité est accrue de 47%. Les expériences ont montré que NeoLux1.2 présente une stabilité thermique exceptionnelle (Tm > 100°C) et une spécificité élevée pour le substrat synthétique DTZ (diphenylterazine). De plus, la demi-vie de décroissance du signal de NeoLux1.2 atteint 43 minutes, bien supérieure à celle des luciférases naturelles, ce qui la rend idéale pour le criblage haut-débit.

2. Conception de systèmes FRET luciférase-protéine fluorescente

Pour permettre l’imagerie bioluminescente multiplexée, l’équipe a fusionné NeoLux1.2 avec différentes protéines fluorescentes (mNeonGreen, mGold, mKok, CyOFP1, mKate2), formant des systèmes FRET efficaces. La structure de chaque couple FRET a été prédite par AlphaFold2, optimisant la distance enzyme-FP pour maximiser l’efficacité du transfert d’énergie. Cinq couples FRET (LuxNeon, LuxGold, LuxKok, LuxOFP, LuxKate) ont été validés expérimentalement, tous affichant une efficacité de transfert d’énergie supérieure à 90 % tout en conservant les propriétés spectrales de la protéine fluorescente.

3. Applications de l’imagerie bioluminescente multiplexée

L’équipe a vérifié les capacités d’imagerie multiplexée de ces systèmes FRET au niveau cellulaire et chez la souris vivante. En cellule, la technique de mélange linéaire (linear unmixing) a permis de différencier avec succès les signaux des différents couples FRET, obtenant une imagerie simultanée de plusieurs structures subcellulaires. In vivo, des cellules Hela exprimant chaque couple FRET ont été greffées chez la souris ; suite à l’injection intraveineuse de DTZ, une imagerie bioluminescente multiplexée a été réalisée avec succès. De plus, l’équipe a suivi en temps réel l’évolution de l’hétérogénéité tumorale (tumor heterogeneity) grâce à ces systèmes FRET, illustrant leur valeur potentielle pour la recherche sur le cancer.

Conclusions et signification

Ce travail, reposant sur l’IA pour la conception de protéines, a permis de développer une nouvelle famille de luciférases, la série NeoLux. Ces luciférases surmontent non seulement les limitations des enzymes naturelles, mais peuvent également être fusionnées à des FP pour permettre une imagerie bioluminescente multiplexée très efficace. L’équipe a démontré la grande applicabilité de ces systèmes FRET aussi bien en cellule qu’in vivo, permettant l’imagerie de multiples compartiments subcellulaires, la surveillance dynamique de l’hétérogénéité tumorale, etc.

Cette étude ouvre de nouvelles perspectives d’application pour la bioluminescence, en particulier en oncologie, criblage pharmacologique, et imagerie biomédicale. De plus, l’équipe met à disposition séquences et protocoles de conception, réduisant significativement les coûts expérimentaux, favorisant l’adoption large de cette technologie en laboratoire.

Points forts de l’étude

1. Conception protéique pilotée par IA : L’utilisation combinée de ProteinMPNN et AlphaFold2 a permis la conception de novo d’une nouvelle série de luciférases, illustrant la puissance de l’intelligence artificielle pour l’ingénierie des protéines.
2. Imagerie bioluminescente multiplexée : Le développement de systèmes FRET très efficaces permet l’imagerie multiplexée, en cellules et in vivo, fournissant de nouveaux outils pour l’étude de processus biologiques complexes.
3. Grande stabilité et spécificité : La série NeoLux se distingue par une très forte stabilité thermique et une haute spécificité pour son substrat, dépassant de loin les luciférases naturelles.
4. Faible coût et large applicabilité : L’ouverture des séquences de conception et des protocoles expérimentaux réduit notablement les coûts, facilitant l’adoption de la technologie par de nombreux laboratoires.

Autres informations pertinentes

L’équipe de recherche a également démontré l’application de ces systèmes FRET pour la surveillance dynamique de l’hétérogénéité tumorale, offrant de nouveaux outils à la recherche oncologique. En outre, le développement de technologies d’imagerie bioluminescente multiplexée à faible coût offre une solution économique et performante à la recherche biomédicale.

Ce travail fait non seulement progresser la bioluminescence, mais fournit aussi un exemple remarquable de l’application de l’intelligence artificielle à l’ingénierie des protéines, avec des implications scientifiques et pratiques majeures.