単一アンチセンスオリゴヌクレオチドはホットスポットエクソンで多様なスプライシング変異を修正する

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希少疾患の遺伝子スプライシング変異「ホットスポットエクソン」は単一アンチセンスオリゴヌクレオチドで広範に補正可能——2025年PNAS最新発表研究レビュー

1. 学術的背景：疾患関連スプライシング変異の課題とアンチセンス療法の難しさ

遺伝子スプライシング（RNA splicing）は、真核生物の遺伝子発現制御における重要なステップである。ほとんどすべてのヒト遺伝子は成熟mRNAの形成過程で、スプライシングによってイントロン（intron）が除去され、エクソン（exon）が成熟転写産物として連結される。この過程は5’末端および3’末端スプライス部位、ブランチポイント、多ポリピリミジン配列などの古典的なシスエレメント（cis-elements）に依存するだけでなく、エクソンやイントロンに内在する多様なスプライシングエンハンサー（splicing enhancers）やスプライシングサイレンサー（splicing silencers）も関与する。遺伝学の研究から、ヒトの病原性変異の最大60%が最終的にはRNAスプライシングに影響し、異常なタンパク質コード生成をもたらすことが示唆されている。それゆえ、スプライシング異常の理解と補正は、希少遺伝病やがんなどの疾患診断・治療における根本的課題である。

しかし現実は非常に複雑である。第一に、スプライシング変異はすべてのエクソンに均一に分布しているわけではなく、一部のエクソンは「変異ホットスポット」（hotspot exons）となり、さまざまな変異で異常スプライシング（例：エクソンスキッピング、exon skipping）を起こしやすいが、多くのエクソンはむしろ「頑健」である。第二に、既存のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ASO, antisense oligonucleotide）はRNAスプライシング制御の精密ツールとして一部疾患（DMD, SMAなど）で承認されているが、現在のカスタムASOは普通は単一変異にしか対応できず、時間もコストも掛かるため希少な遺伝型や少人数の患者層は恩恵を受けにくい。第三に、医学的に意義あるすべてのスプライシング変異や「脆弱な」エクソンの分布を系統的・ハイスループットで同定することも高度な課題である。

このような背景を基に、William G. Fairbrotherのチームは本研究を立ち上げ、次の2点を目指した。1）どの医学的関連遺伝子がスプライシング変異ホットスポットエクソンを持つかを明らかにすること。2）単一ASOでホットスポットエクソン上の多様なスプライシング変異を「広範」補正できるかを探索し、希少疾患への精密治療新戦略を提示すること。

2. 論文情報と研究チーム

本論文「single antisense oligonucleotides correct diverse splicing mutations in hotspot exons」は、Chaorui Duan、Stephen Rong、Luke Buerer、Christopher R. Neil、Yu Zhong、Zhuoyang Lyu、Juliann M. Savatt、Natasha T. Strande、William G. Fairbrotherらが執筆し、主にBrown University（ブラウン大学）およびGeisinger Healthなどに在籍する研究者で構成されている。論文は2025年6月16日に米国科学アカデミー紀要（PNAS）に掲載された。

3. 研究の全体フロー詳細

1. スプライシング変異大規模網羅的スクリーニングとデータセット構築

研究者はまず71の臨床的にアクショナブル（clinically actionable）なヒト疾患遺伝子を特定し（これらの遺伝子は臨床介入価値が高いため、異常スプライシング研究と診断に現実的意義がある）、ClinVar（公開変異データベース）とGeisinger MyCodeプロジェクトからの32,112個のエクソン内一塩基変異（SNV, single-nucleotide variant）を対象とした。これらの変異はさまざまなエクソン領域をカバーし、多様な作用メカニズムに及ぶ。

現行のオリゴヌクレオチド合成長（<230nt）の物理的制約を受け、研究チームは2種のコンストラクトを利用：短いエクソン（120nt以下）は全長クローン、長いエクソン（>120nt）は3’スプライス部位付近90nt断片を解析対象とした。これによりハイスループット実験とクローニング技術の再現性を両立させた。

また、変異検出の汎用性と臨床的意義を保証するため、HexEventデータベースの「コンスティテュティブエクソン」（全転写産物の95%以上に含まれる基準）をもとにエクソンを選定した。

2. 独自開発のハイスループットスプライシング機能スクリーニング系（MaPSy プラットフォーム）

本チームは大規模並列スプライシング機能アッセイ（MaPSy, Massively Parallel Splicing Assay）プラットフォームを開発し、以下のような中核ワークフローを設定した：

  • Agilent高密度オリゴ合成によって全ての標的エクソンと変異型（wild-typeとmutant）DNA配列ライブラリを設計合成；
  • 3エクソン-2イントロンを持つ標準化ミニジーン（minigene reporter）系に、各WTおよび変異配列を同一フレームに組み込んでライブラリ化；
  • HEK293T細胞に導入後のcDNA産物をIlluminaハイスループットシーケンスで定量化し、各種（WT/variant）毎にカウント；
  • それぞれの変異について、output/inputの比（WT/variant）をlog2変換してMaPSyスプライシングスコアを算出；
  • mpralm等の多重統計検定（FDR制御）により、「スプライシング障害変異」（splice-disrupting variants, SDVs）の判別・抽出。

この手法は膨大な遺伝子変異のエクソンスプライシング機能に定量的な実験評価を可能とし、システマティックな遺伝学的研究や標的治療の基盤データとなる。

3. バイオインフォマティクス解析と病原性との関連付け

スクリーニングで得た実験データに基づき、研究チームはさらに以下を行った：

  • ClinVar変異注釈・病原性情報と分子実験結果を対応付け、MaPSyスコアと病原／良性表現型の関連性を検証；
  • 二値ロジスティック回帰（logistic regression）によりMaPSyスコアとClinVar病原性ラベルをモデル化し、スコアが低いほど病原性が高まること（log-odds係数=-0.32、p=1.44e-6）、特に「極端スプライシング障害変異群」（上位2%スコア）で相関が強いことを示した；
  • 進化生物学ツール（phyloP・GERP：進化保存性スコア、CADD：統合病原性予測スコア）を介し、より深刻なスプライシング障害変異はより希少で自然選択によって集団から排除されやすいことも証明；
  • MyCode大規模コホート解析により、重大障害群エクソン変異は一例のみ検出された（singleton）が40%以上を占め、この傾向を補強した。

4. 「ホットスポットエクソン」同定とスプライシング脆弱性判定

データ解析の結果、スプライシング障害変異の分布は実際には均一ではなく、ごく少数のエクソン（「ホットスポットエクソン」）に著しく集積することが明らかとなった。例えばがん関連重要遺伝子BRCA1やMLH1では、少数エクソンにSDVが高密度に集中し、多くのエクソン変異はスプライシングへ影響しなかった。さらに、特定の5mer配列で同じ変異を起こしてもエクソンごとに影響が大きく異なり、局所配列「背景」が変異そのものの「型」よりもスプライシング制御への影響が大きいといえる。

また、全エクソンをin silicoで網羅的疑似変異させた上でSpliceAI解析し、ヒト全CCDS注釈上で「ホットスポットエクソン」パターンが一般的であることを再確認した。

さらに、非特異的スプライシング阻害薬Pladienolide B（Plad B）を用いた細胞実験とRNA-seq解析により、薬物誘導エクソンスキッピングに最も感受性の高いエクソンは予測された「ホットスポットエクソン」と重なった。このことは、これらエクソンが本質的に「スプライシング脆弱性」を持つことを裏付けた。

5. 単一ASOによる「ホットスポットエクソン」多様スプライシング変異の広範補正実験

「ホットスポットエクソン」が多変異で高度に脆弱であることを確認したのち、研究チームは最大の鍵となる仮説を検証した。「同一ホットスポットエクソンに関わる多様な変異であっても、単一のASOで全ての異常スプライシングを補正できるか？」

実験手順は以下の通り：

  • まずPlad B処理でPTEN、LDLR、VHL、TSC1等遺伝子の代表的ホットスポットエクソンで人為的にスキッピング異常を誘導し、上流5’スプライス部位または下流3’スプライス部位を標的とするASOを設計。PCT・qPCR定量で、単一ASO（特に下流3’ssや上流5’ss標的）が異常スキッピングの18%～86%までを逆転させられることを実証；
  • さらに、MaPSyスクリーニングで選出した複数種の実SDV（TSC1 exon 14・MLH1 exon 9のそれぞれ異種変異）に対し、ミニジーンで再構成し、複数設計のASO（分岐点branchpoint標的含む）の各変異における補正能力を詳細に比較。結果、どの変異でも、隣接3’ss/5’ss/branchpoint標的の適切な単一ASOでエクソンのインクルージョンが有意に増加し、異常スプライシングが補正できることが確認された；
  • 分子機構解析では各種PCRプライマーを組み合わせてスプライシング中間体も同定し、ASOが完全長mRNA発現を回復するだけでなく、スプライシングの順序や動力学を調整し、最終的なエクソンスキッピング異常の抑制を実現していることを証明した。

4. 主な研究成果と貢献

  1. 大規模実験的スプライシング機能評価：71の臨床的アクショナブルなヒト疾患遺伝子を対象に、実際に観測された/臨床報告のあるエクソン内約3万種の変異のスプライシング機能を網羅的、システマティックに検証したのは初。
  2. 多数の「スプライシング障害」変異の捕捉：合計1,733個の明確なスプライシング異常誘発変異（SDV）を抽出、そのうち最も重篤なグループ（極端群）はClinVarで30%以上が病原/潜在病原と判定。
  3. 「スプライシング脆弱なホットスポットエクソン」の全体分布：約8%のエクソンのみが「スプライシング変異ホットスポット」に該当するが、SDVの大半がそこに集中。これら「ホットスポットエクソン」は薬理感受性・スプライシングメカニズム脆弱性が高く、遺伝性疾患の異質的スプライシング異常の主要なターゲットである。
  4. ASO補正機構と実証：様々な細胞実験から、どんなスプライシング異常変異でも、ホットスポットエクソン近傍のスプライス部位を標的とした単一ASOでインクルージョン復元できることを明らかにし、その作用機構は異常スプライシング経路の動力学的競合を修正するものであった。
  5. 科学・臨床両面での画期的意義：希少疾患における「多対一」補正という新たな精密治療アプローチを提案——発生頻度は低いが多様なスプライシング異常に対し、単一ASOで複数種類、複数部位変異に対応でき、介入普及性の向上や新薬開発の障壁低減、個別ASO化の補完など幅広い戦略的利点がある。

5. 研究のハイライトまとめ

  • 自律型ハイスループットスクリーニング体制：MaPSyスクリーニング/解析系は大規模スプライシング機能変異同定の技術的基準となり、系統性・高網羅性・生理的妥当性を兼ね備える。
  • スプライシング「ホットスポットエクソン」の全景把握：大型データ解析および実体実験の多元連携により、スプライシング変異はランダム分布せず、希少疾患や腫瘍領域での標的選定・診断の重要根拠を示した。
  • ASO「多対一」広範応用モデル：一度の配列設計で、同一エクソンにわたる多様な変異補正を実現し、人口集団/変異ポートフォリオ全体への反義療法の応用範囲を大幅拡張可能。
  • 機構的イノベーション――スプライシング動力学調整：病的変異点を直接「修復」するのではなく、ASOによってエクソン領域スプライスサイト間の競合バランスを調整し、全体的なエクソンインクルージョン率向上を実現、「バイパス的」補正を進化させる。
  • 臨床応用例の先行指標：例えばBRCA2第13エクソンでは、MyCodeデータベース収載の100例超変異のうち13名のがん患者全員が負値領域のMaPSyスプライシングスコアだった——単一ASOで全例補正が理論上可能となり、遺伝性腫瘍易罹患リスクのゲノム診断・早期介入の実践的意義は極めて大きい。

6. 研究の結論・応用展望・残された課題

本研究は、遺伝子スプライシング異常分布やその分子メカニズム理解を深化させただけでなく、異質性が高く臨床需要の迫った希少疾患・多発腫瘍などに対して「一対多」型の革新的補正ツールをもたらし、遺伝子医薬分野における先進的モデルとなった。

実際的意義は次の通り： - 開発効率が大幅に向上し、希少変異や小規模患者群への臨床展開が実現可能 - 個別化ASO開発の細分化に依存しすぎない標準化・産業化推進を後押し - 精密医療における「遺伝子/エクソンレベル」介入という新潮流を豊かにし、新規薬物タイプ開発を促進

一方、課題として著者も率直に指摘している： - missense変異に関してはスプライシング補正のみ可能だが、コードされるタンパク質自体の構造機能異常は必ずしも解決できない——その場合はCRISPRなどゲノムエディティングと組み合わせたアプローチが要検討 - ASO用量が過多または特異性不足の場合、多エクソンスキッピング等新たな表現型を誘発する懸念があるため、厳格な用量・個体適性評価が必要

7. 結語

本稿PNASに発表された本研究は、分子医学領域におけるエクソンスプライシング異常とアンチセンス療法の新たな境界を開き、実験系・分子地図・新戦略・トランスレーショナルリサーチの全プロセスモデルを体系化した。今後、さらなる疾患種別やエクソン標的で、臨床前～臨床応用段階への展開が期待され、「遺伝子から治療まで」の精密医療サイクルが実現されることで、希少疾患やバリアント型疾患の患者にとって真に実用的な治療選択肢となることが期待される。