METTL3 通过调控 N6-甲基腺苷依赖性原始转录本 hsa-mir-4526 加工促进成骨发生
m6A甲基化修饰促进脂肪干细胞成骨分化新机制揭示——基于METTL3介导hsa-mir-4526初级microRNA剪接调控的研究
一、学术背景与研究动因
骨组织工程（Bone Tissue Engineering）近年来因生物技术、材料科学与再生医学的迅猛发展而成为多学科交叉研究的前沿领域。随着老龄化加剧及创伤、骨肿瘤等疾病导致的骨缺损病例上升，安全有效的新型骨缺损修复与再生方式，尤其是基于干细胞的再生医学策略，成为亟需解决的重点科学和临床问题。
其中，人脂肪来源间充质干细胞（Human Adipose-derived Stem Cells, hASCs）以丰富的来源、优越的增殖潜能与分化能力被广泛接受为骨组织工程理想的种子细胞。但hASCs的成骨分化机制复杂，受诸多分子调控网络及表观遗传修饰影响，目前相关分子机制尚未完全阐明，制约了hASCs在骨再生医学和临床转化中的进一步应用。
N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine, m6A）是真核生物mRNA中最丰富的表观遗传修饰之一，也是当前RNA领域研究的热点。m6A修饰可通过调控基因表达、影响细胞增殖、凋亡、迁移等生命过程，被认为关系到多种疾病的发生和干细胞分化。RNA的m6A修饰过程是可逆的，依赖于甲基转移酶复合物介导，包括甲基转移酶类似物3（Methyltransferase Like 3, METTL3）等关键酶的作用。在干细胞成骨分化领域，m6A修饰的调控作用近年来受到关注，却因相关分子通路和作用靶点尚未清晰，成为学界关注焦点。
microRNA（miRNA，微小RNA）作为一类内源性非编码单链RNA（长度约22nt），通过结合靶mRNA的3’端非翻译区执行转录后调控，广泛参与发育、组织重建、骨代谢等多种生理过程。miRNA的成熟过程自初级microRNA（pri-miRNA）经过Drosha/DGCR8微加工体等一系列复杂剪接。近期研究证实m6A修饰也参与pri-miRNA的加工与成熟，但m6A修饰介导miRNA成熟进而调控干细胞成骨分化的具体机制尚不明。
鉴于此，本文聚焦METTL3-m6A修饰如何影响hASCs成骨分化，尝试从pri-miRNA剪接成熟环节揭示新的骨再生分子机制，欲为骨缺损的精准修复提供全新思路与分子靶点。
二、论文来源与作者信息
本论文题为《mettl3 promotes osteogenesis by regulating n6-methyladenosine-dependent primary processing of hsa-mir-4526》，作者为Yidan Song、Hongyu Gao、Yihua Pan、Yuxi Gu、Wentian Sun及Jun Liu（通讯作者）。研究团队主要隶属于四川大学华西口腔医院国家口腔疾病临床医学研究中心、国家口腔疾病重点实验室正畸学系，以及四川大学华西龙泉医院。论文发表于2025年《Stem Cells》（DOI: 10.1093/stmcls/sxae089）。
三、研究设计与流程详述（a）
本研究从“表观遗传修饰-微小RNA-成骨靶点基因”的分子链路出发，通过一系列体内外实验、转录组与表观组测序、分子机制验证，系统揭示METTL3/m6A修饰调控hASCs成骨分化的新机制。
1. 主要实验流程与分组
体外研究流程
- hASCs细胞培养与成骨诱导：采用第三至第七代hASCs，分为未分化组（u-hASCs）与成骨分化组（d-hASCs）。成骨诱导时间统一为7天。
- METTL3过表达与敲减：通过慢病毒载体转染，分别建立METTL3过表达、敲减及阴性对照组。
- 分子生物学检测：包括Western blot检测METTL3、ALP、RUNX2、TUBB3等蛋白，荧光免疫染色（IF）验证成骨蛋白表达（如RUNX2），以及碱性磷酸酶（ALP）、茜素红S（ARS）成骨染色评估成骨效果。
- miRNA与靶基因功能研究：利用Agomir/Antagomir分别上调/下调hsa-mir-4526表达，进行功能补救实验。
- RNA甲基化及miRNA剪接机制研究：MERIP-seq鉴定成骨诱导前后差异m6A峰的pri-miRNA，MERIP-qPCR定量单个miRNA的m6A修饰，RIP与Co-IP检测pri-miRNA与DGCR8、METTL3蛋白的互作关系。
- miRNA靶基因筛选与验证：通过TargetScan、miRWalk与自身转录组测序联合筛选靶基因，用双荧光素酶报告及RIP-qPCR实验确认互作。
- 靶基因功能与机制：siRNA干扰TUBB3表达，结合ARS/ALP染色与成骨蛋白检测分析其成骨调控作用。
- hASCs细胞培养与成骨诱导：采用第三至第七代hASCs，分为未分化组（u-hASCs）与成骨分化组（d-hASCs）。成骨诱导时间统一为7天。
体内动物实验
- 关键细胞系复合GelMA支架：四组（METTL3干预/对照，hsa-mir-4526干预/对照），分别移植于裸鼠4mm颅骨缺损模型。
- 8周后取材，分别进行micro-CT 3D重建、BMD/BV/TV/Tb.Sp等骨参数量化分析，HE与Masson三色/免疫组化染色评估新骨形成与成骨蛋白表达。
- 关键细胞系复合GelMA支架：四组（METTL3干预/对照，hsa-mir-4526干预/对照），分别移植于裸鼠4mm颅骨缺损模型。
转录组数据与生物信息学分析
- SITUBB3/SINC组细胞RNA-seq，FASTP质控，DESeq2筛选差异基因，ClusterProfiler用于GO/KEGG富集；PPI网络分析骨代谢相关核心通路。
2. 核心创新方法/技术详述
- MERIP-seq与MERIP-qPCR：精准识别并定量RNA上的m6A修饰高峰，捕捉成骨分化期间表观遗传动力学变化。
- Co-immunoprecipitation与RIP：揭示蛋白—RNA/蛋白—蛋白互作，证实METTL3通过与DGCR8复合促进pri-miRNA加工。
- miRNA靶点多重筛选验证：数据库预测、算法和实测数据相结合，辅以双荧光素酶与AGO2-RIP实验，确保靶点筛选的精准性与功能性关联。
- 体内支架移植骨缺损修复评估：结合3D CT及组织学全流程评定，增强成果的实际转化意义。
四、主要实验结果与过程逻辑（b）
1. METTL3可促进hASCs成骨分化（体内外证据）
体外实验，METTL3敲减组ALP/ARS染色变浅，ALP/ RUNX2蛋白表达下调，免疫荧光也显示RUNX2阳性信号降低，提示成骨分化受抑。相反，METTL3过表达则增强所有成骨相关表型。
动物模型中，移植METTL3敲减hASCs的颅骨缺损修复明显受阻，3D重建显示新骨量显著减少，BMD/BV/TV下降，Tb.Sp升高，组织学染色与免疫组化均证实新骨形成及OCN/ALP成骨蛋白显著减少。METTL3过表达组则反之，提示其成骨促进作用具有“体内-体外”一致性。
2. m6A修饰促进pri-miRNA成熟（pri-mir-4526为代表）
MERIP-seq揭示成骨诱导前后数10个pri-miRNA的m6A修饰水平均有显著变化（如pri-mir-4526/5190、pri-mir-6773等），其中通过定量PCR及MERIP-qPCR进一步确认pri-mir-4526 m6A修饰在成骨分化中上升，而其对应成熟miRNA上调。METTL3干扰实验进一步证明，pri-mir-4526/5190在METTL3表达与其m6A修饰水平变化下呈负相关，而成熟hsa-mir-4526与METTL3呈正相关。RIP/Co-IP/突变实验显示METTL3通过提升pri-mir-4526 m6A修饰促进其与DGCR8结合，助力加工成熟为hsa-mir-4526，A突变位点大幅削弱该过程，直接证明m6A修饰的必需性。
3. hsa-mir-4526促进hASCs成骨分化（体内外功能）
下调hsa-mir-4526后，体外RUNX2蛋白/ARS/ALP染色及定量均显示成骨分化被显著抑制，过表达则增强成骨各项指标。更重要的是，体内移植hsa-mir-4526 agomir组的新骨形成量显著高于对照组，antagomir组则新骨生成受阻，骨缺损修复能力、BMD/BV/TV/ Tb.Sp以及所有组织染色与蛋白水平均呈现一致趋势。功能救逆实验表明，hsa-mir-4526可显著回补METTL3敲减引发的成骨分化抑制，即二者在同一路径协同作用。
4. METTL3-hsa-mir-4526调控下游靶基因TUBB3实现成骨调控
筛选发现TUBB3（Tubulin beta 3）为hsa-mir-4526下游关键靶点。数据库、RNA-seq三重筛查，双荧光素酶报告及AGO2-RIP实验证明hsa-mir-4526可直接结合并下调TUBB3。成骨分化中TUBB3表达持续下调，METTL3/hsa-mir-4526激活导致TUBB3进一步下调，敲减二者则TUBB3上升。TUBB3干扰后，RUNX2/ALP等成骨蛋白表达及成骨染色显著增强，提示TUBB3为成骨分化负调控因子。补救实验进一步证实，TUBB3敲低可反转METTL3/hsa-mir-4526缺失导致的成骨抑制，为该通路功能链路提供分子实验证据。
5. TUBB3调控成骨的分子机制（转录组学与生信）
RNA-seq分析si-TUBB3组揭示其下游涉及细胞代谢、钙离子稳态、破骨细胞分化等多条生物通路。PPI分析定位到多个骨代谢核心基因网络，为后续深入发掘TUBB3成骨调控的分子基础提供了生物信息学依据。
五、结论、应用价值与意义（c）
本项研究首次揭示了METTL3通过促进pri-mir-4526 m6A修饰、加快其与DGCR8结合进而成熟为hsa-mir-4526，下调负调控基因TUBB3，最终正向调节hASCs成骨分化的“分子链路”，完整勾画了一个从表观修饰到microRNA到靶基因再到表型的全流程成骨分子机制。这一发现不但拓展了m6A在干细胞成骨分化中的功能认识，还为骨组织工程和骨再生临床治疗提供了重要的分子靶点和机制基础。
具体意义包括：
- 科学意义：首次明确m6A在pri-miRNA剪接成熟调控干细胞命运中的作用，填补该领域理论空白。
- 方法论意义：结合转录组、表观组、功能性动物模型多种技术，提供新型多维研究范式。
- 应用意义：为骨缺损修复、骨再生以及与成骨相关遗传疾病提供潜在靶点（如METTL3/m6A修饰、miR-4526、TUBB3），有助于开发新一代基因或表观修饰治疗手段。
六、研究亮点与创新（d）
- 首次揭示了pri-mir-4526的m6A修饰在脂肪干细胞成骨分化中的核心作用及分子机制。
- 完整搭建了METTL3-pri-mir-4526/hsa-mir-4526-TUBB3成骨调控新轴线，为骨再生领域提供创新理论依据。
- 使用MERIP-seq+MERIP-qPCR新平台高通量解析成骨分化期间miRNA表观遗传调控模式。
- 动物模型中明确验证上述分子事件在真实骨缺损修复中的成效，为后续转化应用与机制药物筛查奠定坚实基础。
七、补充与展望（e）
本研究展示了中国口腔再生医学领域在表观遗传修饰研究的前沿进展，展示了多组学交叉、体内外功能验证及分子机制解析的高度整合。未来，该分子轴线可能优先应用于骨组织工程的临床前研究，也为探索其他干细胞分化方向的m6A-微RNA-靶基因调控提供了参考。上述研究方法和链路模型亦可推广至其他疾病（如骨质疏松、骨折愈合障碍等）。研究团队也建议后续可拓展METTL3/m6A修饰相关药物的小分子筛选与靶向递送平台开发，以进一步实现精准个体化骨修复策略。
总结
本论文结合分子表观遗传学与骨组织工程，创新性揭示了“METTL3→pri-mir4526 m6A修饰与成熟→hsa-mir-4526→TUBB3→成骨分化”这一关键调控链路，为脂肪干细胞成骨新机制与临床骨缺损再生打开新局。该工作不仅丰富了basic science，也为未来针对骨缺损疾病的转化医学研究和治疗干预提供了坚实理论基础与实践示范。