单一反义寡核苷酸可修复热点外显子中的多种剪接突变

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反义寡核苷酸 剪接突变 热点外显子 RNA剪接 可治疗基因 基因突变 疾病治疗策略

罕见疾病基因剪接突变“热点外显子”可被单一反义寡核苷酸广谱矫正——2025年PNAS最新发表研究综述

一、学术背景：疾病相关剪接突变的难题与反义疗法困境

基因剪接（RNA splicing）是真核基因表达调控中的关键步骤。绝大多数人类基因在成熟mRNA形成过程中，都通过剪接作用将内含子（intron）切除，并将外显子（exon）拼接为成熟转录本。这一过程不仅依赖于5’、3’剪接位点、分支点和多聚嘧啶区等经典顺式元件（cis-elements），亦涉及大量分布于外显子和内含子内部的剪接增强子（splicing enhancers）及剪接抑制子（splicing silencers）。遗传学研究表明，多达60%的人类致病突变最终还是通过影响RNA剪接，才致使编码蛋白产生异常。因此，理解并矫正基因剪接异常，是罕见遗传病、肿瘤等疾病诊治领域的重大基础性难题。

但现实非常复杂：首先，剪接突变并非平均分布于全部外显子之中，有些外显子成为“突变热点”（hotspot exons），明显更易因各种突变引发异常剪接（如外显子跳跃，exon skipping），但大多数外显子却较为“稳健”；其次，虽然已有反义寡核苷酸（ASO, antisense oligonucleotide）作为精准RNA剪接调控工具在某些疾病（如DMD、SMA等）中获批上市，但目前定制ASO一般只能针对单一突变，耗时费力且成本高昂，大量罕见基因型和小患者群体难以获益；第三，如何系统、高通量地识别所有医学意义的剪接突变以及剪接“脆弱”外显子的分布，也极具挑战性。

基于这些背景，William G. Fairbrother团队发起并实施了本研究，旨在：1）弄清哪些医学相关基因含有剪接突变高发“热点外显子”；2）探索是否可以用单一ASO“广谱”矫正热点外显子上的多类剪接突变，从而为罕见病遗传精准治疗提供新思路。

二、论文来源与作者团队

本文题为《single antisense oligonucleotides correct diverse splicing mutations in hotspot exons》，由Chaorui Duan、Stephen Rong、Luke Buerer、Christopher R. Neil、Yu Zhong、Zhuoyang Lyu、Juliann M. Savatt、Natasha T. Strande、William G. Fairbrother等共同撰写，主要作者及通讯作者来自Brown University（布朗大学）及Geisinger Health等机构。文章发表于2025年6月16日的*Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America*（PNAS）。

三、研究全流程详解

1. 剪接突变大样本系统筛查与数据集搭建

研究者首先锁定了71个临床可操作（clinically actionable）的人类疾病基因（这些基因由于临床干预价值高，因此异常剪接的研究、诊断有高度实际意义），从ClinVar（公共变异数据库）和Geisinger MyCode项目中共纳入32,112个外显子内单核苷酸变异（SNV, single-nucleotide variant）作为研究对象。这些变异覆盖了构成外显子的不同序列区域，涉及不同的作用方式。

由于现有寡核苷酸合成长度的物理限制（<230nt），研究团队采用了两种类型的构建方式：对短外显子（120nt以内），直接全长克隆；对较长外显子（>120nt），则选取靠近3’剪接位点的90nt片段进行分析。如此可实现高通量实验并保证克隆工艺的可靠性。

同时，为确保突变检测具有广泛性和实际医学意义，外显子的选取标准依赖于HexEvent数据库中“组成型外显子”定义（即95%以上转录本包含该外显子）。

2. 自主研发高通量剪接功能筛查体系（MaPSy平台）

该团队开发并完善了“大规模并行剪接功能筛查”（MaPSy, Massively Parallel Splicing Assay）平台，核心流程包括：

  • 利用Agilent高密度寡核苷酸合成，按特定设计合成所有目标外显子及突变版（wild-type与mutant）DNA序列文库；
  • 以三外显子-两内含子的类型化迷你基因（minigene reporter）体系，将每一WT和variant序列按规则嵌入同一框架，组成文库；
  • 用Illumina高通量测序分析转染HEK293T细胞后的cDNA产物，对每一物种分别计数；
  • 计算每个突变对剪接的影响（变体的output/input与野生型的output/input之比取log2，得到MaPSy剪接评分）；
  • 通过多重统计检验（如mpralm算法，假阳性发现率FDR控制），归类筛选出“剪接损伤变异”（splice-disrupting variants, SDVs）。

此方法能以高吞吐量、定量化地评估成千上万遗传变异对外显子剪接的实测功能影响，为后续系统遗传学和靶向治疗提供坚实数据基础。

3. 生物信息分析与致病性关联

对于筛查得到的实验数据，研究团队进一步开展：

  • 关联ClinVar数据库变异注释和致病性档案，对照实际分子实验结果，检验MaPSy评分与致病/良性表型关系；
  • 以二分类Logistic回归（logistic regression）将MaPSy剪接评分与ClinVar致病性标签建模分析，发现剪接评分越低，变异越倾向于致病（log-odds系数=-0.32，p=1.44e-6），尤其“极端剪接损伤变异”组（得分💯倒数2%）致病性关联更显著；
  • 引入基础演化生物学工具（如phyloP和GERP，进化保守性打分；CADD，致病概率综合评分），证明愈是严重扰乱剪接的变异，愈趋罕见且被自然选择“清除出”人群基因库；
  • 基于MyCode大队列，检索发现严重损伤组外显子变异中，单例（singleton，>40%）占比高，进一步印证此结论。

4. “热点外显子”识别与剪接脆弱性测定

数据挖掘揭示：剪接损伤变异实际远不平均，明显集聚于极少部分外显子（即“热点外显子”）。如BRCA1、MLH1等重要肿瘤易感基因，仅少数外显子出现高比例SDVs，而大量外显子变异则对剪接无实质影响。进一步分析证明，特定5mer序列的同类突变在不同外显子内效果相去甚远，也意味着局部序列“背景”决定了突变对剪接的影响远超突变本身的“类型”。

研究团队还创新性地采用全外显子体外模拟突变（in silico）+SpliceAI算法，对整个人类编码注释（CCDS）进行系统性全基因组扫描，进一步验证“热点外显子”的存在为剪接突变分布的普遍规律。

此外，通过添加非特异性剪接抑制剂Pladienolide B（Plad B）处理细胞并RNA-seq，定量分析了各外显子对药物诱导外显子跳跃的敏感性。结果表明，最易受Plad B影响出现跳跃的外显子与预测的“热点”高度重合，证实了这类外显子本质上的“剪接脆弱性”。

5. 单一ASO对“热点外显子”多种剪接突变的广谱拯救实验

在确认“热点外显子”存在并高度易受多突变影响后，研究团队着手验证其关键假设：“对于同一热点外显子，无论突变种类，是否可以用单一ASO逆转多种剪接异常？”

实验步骤如下：

  • 首先在Plad B处理下，人工诱导PTEN、LDLR、VHL、TSC1等基因典型热点外显子跳跃异常，并设计ASO靶向其上游5’ss和/或下游3’ss。PCT和qPCR定量显示，单一ASO（尤其下游3’ss或上游5’ss）即可逆转18%-86%的异常跳跃；
  • 更进一步，用MaPSy初筛发现的多个真实SDV（如TSC1外显子14、MLH1外显子9的不同突变），构建迷你基因并分别合成多种ASO（含靶向分支点branchpoint），系统比较不同ASO对各种突变诱导异常剪接的逆转能力。结果显示，无论是哪一突变，合适设计的单一ASO（靶向邻近3’ss/5’ss/branchpoint）均能显著提高外显子纳入率，矫正异常剪接；
  • 分子机制实验中进一步用不同PCR引物组合检测剪接中间体，证实ASO作用不仅能恢复全长mRNA表达，还可调整剪接顺序动力学，最终抑制异常外显子跳跃。

四、主要科研结果与贡献

  1. 大规模实验性剪接功能评估：首次针对71个临床可操作人类疾病基因，系统性地评估了3万余种自然/临床观测的外显子内变异对剪接的真实功能影响。

  2. 截获大量“剪接损伤”变异：共识别出1,733个显著干扰剪接的变异（SDVs），其中极端组有超过30%被ClinVar判定为致病/潜在致病。

  3. “剪接脆弱热点外显子”总体分布图谱：仅8%左右外显子可归类为“剪接突变热点”，但集中承载了大部分SDVs。这些“热点外显子”具有高药理敏感性和剪接机制脆弱性，是遗传性疾病异质剪接异常发生的主要靶点。

  4. ASO矫正机制及实验实证：多组细胞实验表明，无论哪种致剪接异常的突变，只要瞄准热点外显子的邻近剪接位点设计ASO，均可恢复正常纳入，机制是通过改变异常剪接竞争动力学，实现剪接路径“偏转”。

  5. 科学与应用双重重大意义：为“罕见病精准治疗”提供了新的“多对一”矫正思路——对低发但高度异质的剪接异常，可以用单一ASO覆盖多类和多位点突变，提高干预可及性，降低新药研发门槛和经济壁垒，亦补足了单突变ASO个性化路线之外的人群/外显子水平矫正策略。

五、研究亮点总结

  • 高通量体系自主搭建：MaPSy筛查及分析平台为大量剪接突变功能鉴定建立了技术范式，兼得系统性、高通量和实验的生理相关性。
  • 剪接异常“热点外显子”全景分布：大规模、库内外实验相结合确认剪接突变并非随机分布，为罕见病、肿瘤等领域的基因诊断和靶向治疗靶点遴选提供数据基础。
  • ASO的“多对一”广谱应用方案：通过一次序列设计，实现对同一外显子多类突变的矫正，理论上可大幅扩展反义疗法在人群、突变位点间的适用范围。
  • 机制创新——剪接动力学调控：不是直接“修复”病变点，而是通过ASO调整外显子区域剪接竞争，整体提升外显子纳入率，从而“旁路”补救多种致病突变。
  • 临床试用参考案例：如BRCA2第13外显子，在MyCode数据库中百余例突变涉及13例癌症患者——理论上单一ASO即可普遍矫正其剪接缺陷，对种系肿瘤易感性检测及早期预警意义重大。

六、研究结论、应用前景与不足展望

本项研究不仅深化了我们对基因剪接异常分布及其分子机制的认知，更为应对高度异质、临床需求迫切的罕见病、多发肿瘤等疾病中的剪接异常带来了“以一当多”的创新矫正工具，为整个基因药物领域提供了重要探索模型。

实际意义层面，所提出的单一ASO策略具备以下优势： - 极大提高研发效率，特别在罕见变异、小群体患者中实现临床转化； - 降低个性化ASO研发过度碎片化的弊端，利于药物标准化、产业推广； - 丰富精准医学“基因/外显子层面”干预理念，推动全新药物类型开发。

局限性方面，作者也坦诚提及： - 针对missense突变仅恢复正常剪接，但错义突变本身蛋白功能异常未必“被治愈”，需CRISPR等核酸层修饰方法合并考虑； - ASO剂量过高或特异性不佳时，可能导致多外显子跳跃等新型表型，需严格剂量/主体筛选。

七、结语

这项发表于PNAS的原创性系统研究不仅拓展了分子医学领域外显子剪接异常及反义疗法的边界，而且提供了实验平台、分子图谱、创新思路和转换医学全流程范式。期待未来在更多疾病类型、外显子靶标及临床前/临床阶段转化应用中，实现真正“从基因到治疗”的精准闭环，为罕见病与变异型疾病患者带来更切实可行的治疗利器。