物理組織特性に基づいた準空間的単一細胞トランスクリプトームが肝臓の早期老化関連ニッチを定義する

2025-06-28 Sat
肝臓初期老化微小環境の再定義：Quasi-spatial単一細胞トランスクリプトームが線維化ニッチの形成と細胞異質性を解明背景と研究動機老化は生命過程において不可避な現象であり、その最も顕著な特徴の一つが臓器組織内の老化細胞（senescent cells）の蓄積です。これらの細胞はしばしば組織損傷によって誘導され、加齢とともに免疫監視機能の低下により、より除去されにくくなります。老化細胞の存在とそれが分泌する炎症関連分子（いわゆる老化関連分泌表現型：SASP）は、組織微小環境に複雑な影響を及ぼし、生理的修復に関与する一方で、慢性炎症を惹起し組織の恒常性を損なう場合があります。しかし現在の技術では、これらの細胞が組織内でどのように分布し、どのような表現型的多様性があり、また微小環境にどのように影響するかという点で多くの課題が残されています。特に線維化が発生しやすい肝臓のような重要臓器において、老化細胞関連ニッチの形態、動的発展法則、および各種細胞間の複雑な空間的相互作用関係は未だ明確ではありません。
近年、単一細胞オミクス技術の進展によって、我々は細胞レベルで複雑な組織を分層的に解析できるようになりました。しかし主流の単一細胞および空間オミクス法は、技術的ボトルネックや細胞タイプの存在比の違いにより、線維化ニッチの細胞構成をとらえ損ねがちです。この種の細胞は通常、標準的な組織解離プロセスにおいて、ECM（細胞外マトリックス）が豊富なため得られにくいのです。したがって、老化関連線維化ニッチを濃縮・定位し、マルチオミクスレベルで描き出す新しい方法を模索することは、肝臓老化機構の解明や抗老化対策の開発という科学的難題といえます。
論文の情報と著者背景本論文は国際的権威誌Nature Agingの第5巻、2025年5月号（929-949ページ）に掲載されました。主な著者はkwon yong tak、juyeon kim、myungsun park、wooseok kim、seoyeong leeらで、韓国KAISTやKRIBBその他複数の研究機関に所属しています。通信著者はkimchuna@kribb.re.krとjp24@kaist.ac.krです。これらの機関はバイオメディカル分野で高い基盤とイノベーション能力を有しています。
研究デザインと革新的手法（a）研究対象とグループ分け本研究は自然老化マウス肝臓の線維化ニッチに焦点を当て、5-6ヶ月齢（若年群）および22-24ヶ月齢（高齢群）の雄性マウスをモデルとしました。異なる年齢の肝組織微小環境の差異を明らかにするため、従来型コントロール群とfibrotic niche enrichment sequencing（fini-seq）ニッチ濃縮群をそれぞれ若年・高齢サブ群に分けて設定しました。サンプル総数は18で、若年/高齢各群にはそれぞれ3-4匹/5-6匹のマウスを組み入れています。
工程フローと技術革新ニッチ濃縮プロセスのイノベーション

研究チームはまずSirius-red特殊染色およびコラーゲン免疫蛍光により、マウス肝切片の線維化領域を組織学的に定位し、加齢とともに肝臓の大血管周辺域で明らかなECM富化とコラーゲン沈着が起きることを確認しました。

ニッチ細胞の選択的濃縮を目指し、チームはECMが多い領域が酵素消化されにくい物理的特性を利用して「二段階消化」分離法を構築しました。最初の通常解離で残った未消化組織塊をさらに酵素消化・体外培養したところ、その産物は形態的多様性・in vitro増殖能が高く、分泌されるECMもより多量かつ高密度であることが分かりました。原子間力顕微鏡による測定でも、この部分のECMの硬度が高いことが示され、プロテオミクス定量も多様なECMタンパクや炎症性ケモカインCXCL12の高発現が確認されました。

この技術フローはfibrotic niche enrichment sequencing（fini-seq）と命名され、その後の単一細胞RNAシーケンス（scRNA-seq）および単一核ATACシーケンス（snATAC-seq）の重要な前提となりました。
単一細胞/単一核オミクスとデータ解析

fini-seqで分離した細胞サンプルに対し、scRNA-seqとsnATAC-seqを行い、従来の一回消化で得た対照群と対比させ、ニッチ関連の希少細胞濃縮効果を定量化しました。計84,351個の細胞（RNA 解析）と22,377個の細胞核（ATAC解析）を検出しました。

データ解析にはharmonyによるバッチ補正、leidenクラスタリング、既知系譜マーカーによるアノテーションを組み合わせました。組織解離由来のバッチ効果やデータバイアスを排除するため、非負値行列分解（NMF）アルゴリズムで高解離バイアス遺伝子を識別・除外しました。空間解析では、RNA原位ハイブリダイゼーション（RNAscope）、空間トランスクリプトーム（VisiumやStereo-seq）、免疫蛍光・フローサイトメトリーなど多段階手法を連携し、多次元・全空間での系統的解析を行いました。
新規性及び独自技術
物理的性質に基づくニッチ細胞濃縮では、従来の単一細胞技術が捕捉できなかったECMリッチなニッチ細胞を有効に濃縮します。
fini-seqのマルチオミクス連携により、表現型・トランスクリプトームからエピゲノムまで微小環境の異質性変化を体系的に明らかにします。
空間オミクス＋原位ハイブリダイゼーションで、ニッチ細胞が肝臓の解剖学的部位（門脈領域）にどのように分布しているかを正確に描写します。
主な研究成果と結果詳細（b）1. 老化は肝臓線維化ニッチの細胞組成を再構築するニッチ濃縮群はコントロール群より年齢依存的ニッチ微小環境を正確に代表し、特に高齢マウス肝で線維化細胞、内皮細胞（EC）、免疫細胞の著明な富集が観察されました。fini-seqサンプルのECM生成能は高く、基質密度も硬度も大きく、プロテオミクスではコラーゲンXIV（Col14a1）の顕著増加がみられましたが、主要なコラーゲン（Col1・Col3）の発現変化は顕著ではありませんでした。
2. 高度な異質性を持つ老化関連細胞サブセットの発見内皮細胞（Endothelial cells, EC）

fini-seqで濃縮された高齢ニッチ部位では、従来型肝特異的LSEC（肝洞様内皮細胞）が大幅に減少し、「線維化内皮細胞（fibrotic ECs）」が大量に出現します。これらのECは肝臓の空間的遺伝子発現特性を失い、小腸や心筋など他臓器のEC系統に近いトランスクリプトームとなります。機能的には、ケモカイン・炎症・老化関連遺伝子（CXCL10、IL6、CDKN1A、CDKN2A）が高発現し、エンドサイトーシスやクリアランス能力が低下し、肝組織の慢性炎症や病的リモデリングを助長すると推測されます。

4種のfibrotic ECサブタイプのうち、Sema3g高発現の「ec_sema3g」が半数以上を占め、Notch、P53、MAPK経路や典型的な老化分子特性を示します。空間原位ハイブリダイゼーションではこれらが肝門脈周囲に特異的に集積し、加齢に伴いCDKN1Aとの共発現比率が増加しました。
血管平滑筋細胞（vSMCs）

IL6高発現を特徴とするvSMC_il6highがニッチ内で富集し、その数は高齢群で2.2倍に増加しました。これらの細胞は炎症・p53・免疫調節・血管新生関連経路も上昇し、老化遺伝子セット（SenMayo）が著明に活性化されています。
線維芽細胞（Fibroblast）・肝星状細胞（HSCs）

詳細なサブクラスタリングにより、多様な線維芽細胞サブタイプが明らかとなりました。特にfb_wif1とfb_smoc1という免疫相互作用型線維芽細胞がニッチで高頻度に富集し、fb_smoc1はECM合成およびPI3K/AKT活性化にも関与、老化との強い関連を示しました。空間染色でもfibrotic ECsと共に門脈周辺へ集積することが確認されました。
3. 免疫環境の再構築——T細胞のリクルートと疲弊化ニッチ部位細胞の80％は免疫細胞で、そのうちT細胞の占有率が過半数です。サブタイプ解析では、加齢に伴いCD8+組織常在記憶T細胞（CD8+ TRM）、特にPD-1^high枯渇サブ群の著増が明らかになりました。細胞間相互作用解析やフローサイトメトリーの結果からも、ニッチ領域でのT細胞高吸着・疲弊傾向が確認され、fibrotic ECsによるPD-L1高発現による免疫寛容、老化細胞の除去逃避との直接的関係が示唆されます。
4. エピゲノム機構と空間的異質性fini-ATAC-seqの結果、fibrotic ECにおけるクロマチン開放領域はNF-κB、HIF1aなど重要転写因子モチーフで顕著に富集し、低酸素ストレスや慢性炎症シグナルがニッチ形成や細胞リプログラミングの駆動因子であることを示唆します。fibrotic ECは加えて、OSKM（Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc）などリプログラミング因子の特徴も獲得しました。空間オミクス解析では、ニッチ細胞が門脈周囲に斑状・モザイク的に分布し、fb_wif1が急性期応答、fb_smoc1が慢性リモデリングを担うなど、異なるニッチ細胞間の空間的異質性も明らかになっています。
研究結論および学術的意義（c-d）本研究は、物理的性質を利用したニッチ細胞濃縮＋マルチオミクス統合解析であるfini-seq技術体系を初めて発表し、肝臓初期老化微小環境の動的進化、多細胞系統再構築、分子駆動因子を体系的に解き明かしました。主な結論とその意義は以下の通りです。
自然老化下の肝線維化ニッチ全体像と空間分布を初めて描き、肝老化の全体進展と精密介入の理論基盤を提供。
fibrotic ECやfb_smoc1など新規細胞サブタイプを解明し、従来法が見逃してきた「解離困難」な重要細胞の機能的解明に貢献。
低酸素・慢性炎症・細胞間相互作用（PD-L1/PD-1軸など）がニッチ形成を駆動する新機構を提示し、抗老化・抗線維化治療標的の科学的根拠を与える。
免疫相互作用型線維芽細胞の段階的機能分業モデルを提示・検証し、免疫リクルート/基質リモデリングの時間窓と役割に新たなシナリオを提案。
空間オミクスにおいて異質性斑状分布のニッチ構造を解明し、組織病変発端・波及・進展経路の新しい見方を与える。
fini-seqは他臓器・疾患（初期線維化、肝硬変、固形腫瘍など）にも応用可能なプラットフォームとしての展開潜力を提示。
研究限界と今後の展望著者らは、fini-seqによる一部細胞タイプ（例：肝細胞）の検出感度と定量精度には依然として限界があることを認めています。特に大きくて脆弱な細胞（例えば肝細胞）は二重消化過程で損失リスクがあります。今後は単核RNA-seq等との組み合わせも検討されるべきです。また、物理的濃縮のターゲットとなる「難消化性」特性は解剖学的な構造の剛性にも影響を受ける可能性があるため、今後はより精密な生物物理パラメータの評価が必要です。
まとめ本研究はfini-seq技術を軸とし、マルチオミクス・多様な手法および空間統合というアプローチで、「肝老化ニッチ」全細胞・全空間の研究パラダイムを築きました。従来の単一細胞オミクスの限界を打破し、初期病変の微小環境と免疫調節の複雑な相互関係を解き明かしました。今後、関連技術は肝臓など臓器の老化機構の理解、早期警告や標的介入のための体系的解決策となり得るだけでなく、老化研究およびトランスレーショナルメディシンに新たな突破口をもたらすことが期待されます。