Runx1是调控非造血中胚层发育的人类造血关键诱导因子

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RUNX1在人类造血发育中的主导作用与非造血中胚层命运平衡——解读《runx1 is a key inducer of human hematopoiesis controlling non-hematopoietic mesodermal development》

一、学术背景与研究动因

造血系统的发育是高等生物生长与生命维持的根本保障。早期研究在小鼠模型中表明转录因子RUNX1（Runt-related transcription factor 1，也被称为AML1/CBFA2）在“决定性造血”（definitive hematopoiesis）的发生过程中起着不可或缺的作用。人类造血与小鼠虽有部分机制相似，但又存在显著差异，尤其是在早期造血、各分化阶段调控通路及多能干细胞分化命运等关键环节。此前，学界对于RUNX1在人类早期造血过程的具体作用、其调控非造血中胚层命运的机制存在诸多未解之谜。

此外，RUNX1位点的基因突变或重排在急性髓系白血病（acute myeloid leukemia, AML）等恶性血液病中也常被检测到，其在造血细胞命运决定、恶性血液病发生发展中的深层作用机制亟待厘清。更为重要的是，关于RUNX1在人类非造血中胚层细胞（如间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSC）、血管内皮细胞等）发育过程中的调控功能，相关报道几乎为空白。

在这一背景下，本文作者开展了系统性的研究——试图通过遗传操作与分子生物学手段，揭示RUNX1在指导早期人类造血发育和抑制非造血中胚层命运中的关键作用，并解析其上下游调控通路与发育分支平衡的分子网络。

二、论文来源与作者信息

该研究论文题为“runx1 is a key inducer of human hematopoiesis controlling non-hematopoietic mesodermal development”，发表于2025年《Stem Cells》（Oxford University Press出版，卷号43，第5期，编号sxaf019，DOI: 10.1093/stmcls/sxaf019）。论文的主要作者包括Zahir Shah、Cuihua Wang、Hanif Ullah、Hao You、Elena S. Philonenko、Olga V. Regan、Pavel Volchkov、Yong Dai、Jianhua Yu与 Igor M. Samokhvalov，其中多位作者具有共同第一作者（‡标识）。研究工作主要由中国科学院广州生物医药与健康研究院、City of Hope国家医疗中心、Sun Yat-Sen University、Lomonosov Moscow State University等国际著名科研机构共同完成，通讯作者为Igor M. Samokhvalov博士。

三、研究流程与实验设计详述

1. 实验总体设计

整项研究围绕“基因编辑建立RUNX1报告和敲除人类多能干细胞（human pluripotent stem cells, hPSCs）模型，在模拟人类早期造血发育体系中系统跟踪RUNX1表达及其功能”展开。实验流程包含以下几个主要环节：

  • a) 构建RUNX1报告/敲除hPSC细胞株：
    利用TALEN（Transcription Activator-Like Effector Nucleases）技术，将荧光蛋白（tdTomato或Venus）报告盒整合至RUNX1基因（特定位点为第3号外显子区域），并通过同源重组实现RUNX1基因功能的阻断。该操作经过PCR、Southern blot等方式验证入靶的正确性，并获得monoallelic（单等位基因）与biallelic（双等位基因）敲除细胞株。

  • b) hPSCs分化模拟人类造血发育体系：
    采用无细胞因子（cytokine-free）、高度复现性的人胚胎干细胞体（embryoid body, EB）诱导分化体系，模拟人类早期造血发育过程，动态采集不同分化阶段的细胞。实验中采用磁珠分选、流式细胞术（FACS）等手段对造血及非造血细胞亚群进行分型与纯化。

  • c) 分子与转录组水平功能检测：
    结合实时荧光定量PCR（qRT-PCR）、Western blot、RNA测序（RNA-Seq）、流式细胞术、克隆形成单位测定（Colony Forming Unit，CFU）等多层次检测；生信分析则运用Bowtie2、RSEM、DESeq2、clusterProfiler等工具完成大数据处理与通路富集分析。

  • d) 系统评估RUNX1缺失对发育命运的影响：
    包括对primitive（原始）及definitive（决定性）造血谱系、间充质谱系、血管内皮谱系的发育评估，以及关键转录因子、信号通路（如BMP、SOX等）表达的转录组追踪。

  • e) RUNX1功能拯救实验：
    构建doxycycline（Dox）诱导可控表达的PiggyBac-Runx1c转基因系统，转染至RUNX1双等位基因敲除细胞，评估RUNX1外源性补偿表达对造血分化的能力恢复作用。

2. 实验对象及样本规模

  • 主要实验对象为人胚胎干细胞系（H1 hESC）。通过基因编辑与筛选获得多株monoallelic和biallelic RUNX1基因敲除报告细胞系，并与同源野生型细胞对照。
  • 各大组实验（如分化相关实验/转录组等）的样本量通常为三个独立生物学重复，部分实验涵盖二至四个不同基因型的同系细胞亚群（如KO-1、KO-2双敲，Runx1^Tdt/+单敲，野生型）。

3. 核心实验流程详解

3.1 RUNX1报告与敲除细胞系的建立及表达追踪

  • 设计TALEN对RUNX1外显子3上游区域切割，高效同源重组插入带有转录终止信号的荧光报告盒，实现精准敲除。融合Engrailed-2基因的splicing acceptor，以确保报告盒能准确反映RUNX1启动子的激活。
  • 流式分析和qPCR联合显示，RUNX1表达从分化极早期（第2天的CD43^–CD235a^–前体）即被激活，并广泛出现于中胚层未定向细胞、初生血细胞及造血内皮细胞（hemogenic endothelium, HE），其表达强度自造血诱导至骨髓细胞分化阶段逐步递减，反映其时空特异性调控过程。

3.2 RUNX1敲除对原始与决定性造血发育的影响

  • 原始造血受阻：
    biallelic RUNX1敲除细胞虽能产生CD34^+CD43^+早期造血前体（表明最早造血过渡对RUNX1并非绝对依赖），但进一步成熟的CD43高表达细胞比例大幅减少，Primitive Erythroid、Megakaryocyte（巨核细胞）及Myeloid（髓系）分化均受严重抑制。CFU实验显示单等位基因敲除亦存在分化能力下降（RUNX1剂量不充足对原始造血已造成明显影响）。此外，GATA1、KLF1、MYB等红系关键转录因子表达均显著下调。

  • 决定性造血完全被阻断：
    第12天分化后，RUNX1双等位基因敲除细胞基本丧失CD45^+造血细胞能力，分化体系中T淋巴细胞、NK细胞谱系亦被完全切断，造血克隆能力彻底丧失。流式复合染色证实HE细胞数量反常性扩增但无法进一步经历Endothelial-to-Hematopoietic Transition（EHT）向下游造血发展。

3.3 非造血中胚层命运的偏移与上游网络调控

  • RUNX1损失导致CD43^–CD146^+CD90^+CD73^+间充质前体（Mesenchymal Precursor Cells, MPCs）及CD31^+CD34^+CD146^+内皮样细胞（Endothelial-like Cells）逐步扩增；同时，BMP通路成员、SOX家族转录因子（尤其SOX9、SOX5/6）、RUNX2等非造血发育关键基因的表达上调，暗示MPC分化能力增强以及软骨发生、血管生成等非造血命运“转向”。
  • 转录组分析证实，差异表达基因（DEGs）在第12-20天分化过程中大量富集于中胚层非造血发育相关通路（如BMP信号通路、SOX信号、Notch通路、细胞黏附分子等）。

3.4 外源性RUNX1功能拯救实验

  • 采用PiggyBac转座系统将Dox诱导型RUNX1c表达盒转染至RUNX1双敲细胞，定时加入Dox于分化6-12天有效激活RUNX1表达，显著恢复CD45^+、CD34^+CD45^+造血能力。CFU实验证实红系、髓系及巨核谱系克隆形成能力同步恢复，且相关细胞呈现强烈mCherry/tdTomato双重荧光标记。
  • May-Grünwald染色进一步验证救回细胞中典型的巨核细胞、巨噬细胞、粒细胞等多谱系分化能力。

四、主要研究结果与科学发现

  1. RUNX1为人类造血顶级诱导因子，决定原始与决定性造血的启动与进行。
    RUNX1缺失可阻断从HE到各类成熟造血细胞的分化，证明其上游作用超越以往鼠类模型中的TAL1/SCL等经典调控通路。RUNX1对于人类造血关键转录因子（如SCL/TAL1、GATA2、GFI1/1B、FLI1等）表达具有决定性支持作用。

  2. RUNX1独特调控人类中胚层多能命运，直接抑制非造血谱系扩增。
    RUNX1缺失细胞系在造血分化中展现非造血特征细胞的异常扩增与功能分化，该过程伴随BMP-SOX等关键信号增强，而造血相关基因表达大幅抑制；进一步拓展了RUNX1于骨骼、软骨、血管发育和EMT（上皮-间充质转变）等多领域的作用认知。

  3. 首次揭示人类造血发育出现RUNX1独立的原始红系细胞亚群。
    该部分CD235^highCD34^–CD41a^–原始红细胞出现于分化前期，不依赖于RUNX1且缺乏克隆形成能力，提示可能存在与经典造血干/祖细胞不相关的特殊分化路径。

  4. RUNX1的表观剂量效应与造血稳态的精细调控。
    单等位基因敲除呈现“剂量不足”表型，部分造血能力下降，反映RUNX1在造血系统发育中的剂量依赖性临界值。

  5. 外源功能补偿可精准恢复造血能力，展示临床应用潜力。
    通过诱导型RUNX1c补偿，能有效拯救各谱系造血功能，为干细胞治疗、遗传性造血缺陷及AML相关技术提供了直接的实验依据。

五、结论、意义及应用价值

本项研究明确提出且系统验证了：RUNX1不仅是人类早期造血诱导的“总开关”，同时对中胚层命运分支实施主动且持续的调控——激活造血分化程序、同步抑制非造血间充质/内皮命运过度扩增。 这些发现不仅改写了人类造血调控“主轴”的认识体系，也深刻解释了造血/非造血发育平衡对人类胚胎发育与干细胞分化的根本意义。

对于解析AML等白血病发病机制、理解骨髓微环境异常对造血影响，以及MSC等非造血谱系在血液病中的功能异常，本研究提供了坚实的理论与实验基础。更重要的是，其“诱导—报告—敲除—功能补偿”完整研究链路及开创性的细胞系工具，为再生医学、干细胞治疗、发育生物学等领域开辟了新方向。

六、研究亮点及创新点

  • 独创性实验模型：首次在hPSC水平建立了高通量、可视化追踪与敲除一体的RUNX1功能丧失细胞系，构建高分辨率细胞命运映射体系。
  • 多组学集成解析：研究跨越表型、克隆形成、分子、转录组全维度，详尽勾勒基因调控网络，并验证功能相关性。
  • 深入揭示非造血命运调控机制：突破了以往纯造血研究范式，系统解释RUNX1调控中胚层发育多样性的分子基础，对胚胎发育平衡及疾病发生有重要启示。
  • 临床转化潜力突出：拯救实验验证了RUNX1精准调控下多能干细胞定向分化潜力，可为造血重建、基因矫治和血液病防治等应用提供新策略。

七、其他有价值信息

  • 研究数据已公开于GEO数据库（编号GSE232147），为同行提供了进一步分析与转化基础资源；
  • 论文附录提供了详细的试剂、实验流程、原始数据与分析代码，保证了研究的可复现性；
  • 作者团队涵盖中、美、俄多国顶级基础与转化医学力量，展现了国际合作攻坚发育生物学重大前沿问题的范例。

八、总体评价与展望

该研究不仅在学术上提出了人类造血命运调控与中胚层发育命运平衡全新理论，还为造血、骨骼、血管、软骨等多系统的干细胞开发和疾病治疗带来了广阔展望。未来，这类“多能调控—多谱系制衡”机制有望成为解析其他发育决定及慢性疾病发生的新切口。RUNX1及其网络机制的深入挖掘，也将持续推动生物医学、干细胞与再生医学领域的理论和应用创新。